賈莉婷 田 遠(yuǎn) 石 瑛 張琳琳 楊小倩 榮守華 張玉超 李 靜

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，并呈逐年上升趨勢，部分大城市報(bào)告乳腺癌已成為女性惡性腫瘤之首［1］。根據(jù)2011 年St Gallen 乳腺癌分子分型共識(shí)，利用ER、PR 和Her2 三種分子標(biāo)志物，將乳腺癌分為luminal A 型、luminal B 型、Her-2陽性型和basal-like 型，其中basal-like 型乳腺癌基底樣上皮分子標(biāo)志物高表達(dá)，同時(shí)缺乏ER、PR 和Her-2 的表達(dá)［2］，因此該型乳腺癌侵襲性強(qiáng)，內(nèi)分泌治療和分子靶向治療對(duì)其無效［1］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌遷移的重要過程，其與E-鈣黏連蛋白的丟失密切相關(guān)［3］。Snail 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的也是最重要的E-鈣黏連蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子，包括三種類型:Snail1(Snail)、Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)［4］。已有研究表明:在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺癌細(xì)胞等腫瘤中，miR-200 具有與Slug 的結(jié)合，降低E-鈣黏連蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT、阻滯細(xì)胞遷移的能力［5，6］。miR-200 家族已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在basal-like 型乳腺癌BT549 細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)［7］，該家族包括五種miRNA:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141 和miR-425［7，8］。然而，miR-200 家族在basal-like 乳腺癌中是否與Slug 具有相關(guān)性，尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究將以乳腺癌細(xì)胞系BT549 作為研究對(duì)象，將miR-200c 轉(zhuǎn)染進(jìn)入BT549 細(xì)胞中，探討miR-200c 是否可以通過抑制Slug 基因的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)E-鈣粘連蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，以期為臨床靶點(diǎn)治療提供有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株BT549 購自ATCC(美國)。

1.1.2 miR-200c 合成 由Standar 公司完成miR-200c 模擬物設(shè)計(jì)。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基購自solarbio 公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco 公司，細(xì)胞消化液Tripple 與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 均購自Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司，Transwell小室購自Costar 公司，Transwell Chamber 購自BD Biosciences 公司，Slug 單克隆抗體購自Stanta cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)BT549 細(xì)胞，并將其置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為3 組，分別為miR-200c 組(轉(zhuǎn)染miR-200c組)、miR-control 組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組)和對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。接種24 h 后，待細(xì)胞融合率達(dá)到80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，分別將miR-control 和miR-200c 模擬物轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的BT549 細(xì)胞中，終濃度為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h 后，換含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 Real-time PCR 將轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，按照康為世紀(jì)公司的RNA提取說明書提取細(xì)胞總RNA，測定各組RNA 的濃度和純度，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μl，其反應(yīng)程序?yàn)?37℃，15 min;50℃，5 min;98℃，5 min;4℃，hold。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR，擴(kuò)增程序?yàn)?95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min。共40 個(gè)循環(huán)。以目的基因相對(duì)表達(dá)量作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。目的基因相對(duì)表達(dá)量=內(nèi)參基因的CT 值/目的基因的CT 值，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

1.2.4 Transwell 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 在接種細(xì)胞之前，需要對(duì)Transwell 小室和24 孔板進(jìn)行平衡:分別在上室加100 μl 無血清培養(yǎng)基，下室加600 μl FBS，置于37℃，5%CO2環(huán)境下過夜。收集轉(zhuǎn)染后經(jīng)過24 h 饑餓處理的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于上室，在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，隨后將上室細(xì)胞擦除，將小室膜下室側(cè)的細(xì)胞甲醇固定，蘇木素染色后進(jìn)行切膜、拍照，高倍鏡下取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值，每組重復(fù)3 次。

1.2.5 Western blot 試驗(yàn) 收獲轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，并用PBS 洗滌3 次后加入混有蛋白酶抑制劑的蛋白提取液50 μl，在冰上震蕩15 min，4℃條件下14 000 r/min 離心15 min，提取上清，即可得到蛋白質(zhì)溶液，用BCA 法按說明書要求定量測定后，放入-80℃保存。配制12%分離膠，5%濃縮膠，將蛋白質(zhì)溶液按比例加入4×loading Buffer 混勻，在95℃下變性10 min 后加樣，在80 V 電壓下電泳至樣品游動(dòng)至分離膠后改為120 V，直至樣品電泳到分離膠底部。將膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到NC 膜上，用1×TBS 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄去脫脂奶粉，加入一抗兔抗人的Slug 抗體或兔抗人的β-actin 抗體，于4℃下孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加入羊抗兔的二抗，于室溫下?lián)u動(dòng)1 h 后檢測，用ODYSSEY Clx 檢測與成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并拍照，分析條帶的灰度值。觀察三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中蛋白條帶顏色的深淺程度并比較。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，換成無血清培養(yǎng)基使細(xì)胞饑餓12 h 后，用10 μl槍頭在孔板中心軸處劃痕;再用培養(yǎng)基清洗漂起的細(xì)胞，并在顯微鏡下拍照(0 h);在無血清培養(yǎng)基中，將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24 h，再次拍照(24 h)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，單次實(shí)驗(yàn)3 個(gè)復(fù)孔。

表1 目的基因Slug 及E-鈣黏連蛋白和內(nèi)參基因GAPDH 的PCR 引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and product length of target gene Slug，E-cadherin and internal control gene GAPDH

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c 對(duì)乳腺癌BT549 細(xì)胞遷移的影響 Transwell 遷移試驗(yàn)表明:miR-200c 組分別與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 組相比，miR-200c 組BT549 細(xì)胞的遷移能力均明顯減弱(見表2 和圖1)。

表2 miR-200c 對(duì)BT549 細(xì)胞遷移能力的影響Tab.2 Effect on migration capacity of BT549 cell for miR-200c

圖1 Transwell 檢測miR-200c 對(duì)BT549 細(xì)胞遷移能力的影響(×400)Fig.1 Transwell migration assay of BT549 infected with miR-200c mimic(×400)

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-200c 對(duì)BT549 細(xì)胞遷移能力的影響(×200)Fig.2 Wound healing assay of BT549 infected with miR-200c mimic(×200)

2.2 miR-200c 對(duì)Slug 和E-鈣粘連蛋白表達(dá)的影響 Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)表明:miR-200c 組分別與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 組相比，Slug mRNA 的表達(dá)均明顯降低，E-鈣粘連蛋白mRNA 的表達(dá)明顯升高(見表3 和圖3)。

劃痕實(shí)驗(yàn)表明:miR-200c 組分別與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 組相比，miR-200c 組BT549 細(xì)胞的遷移能力明顯降低(見圖2)。

Western blot 試驗(yàn)表明:miR-200c 組分別與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 組相比，Slug 蛋白表達(dá)量明顯降低(見圖4)。

表3 三組細(xì)胞中Slug 和E-鈣黏連蛋白mRNA 的表達(dá)Tab.3 Effect on expression of Slug mRNA and E-cadherin mRNA of BT549 cell for miR-200c

圖3 miR-200c 對(duì)BT549 細(xì)胞中Slug 和E-鈣黏連蛋白mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effect on expression of Slug mRNA and E-cadherin mRNA of BT549 cell for miR-200c

圖4 miR-200c 對(duì)BT549 細(xì)胞中Slug 的影響Fig.4 Effect on expression of Slug protein of BT549 cell for miR-200c

3 討論

乳腺癌從起始到終末階段是一個(gè)多步驟多因素的漸進(jìn)過程，受到一系列基因的調(diào)控，其中EMT 過程是乳腺癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要的早期步驟［9］。

miRNA 作為基因的調(diào)控者，參與了EMT 過程的調(diào)控。關(guān)于miR-200 家族的研究，大多集中于其對(duì)E-鈣黏連蛋白抑制物ZEB1 和ZEB2 的作用效果［10，11］。2008 年，Park 等［12］發(fā)現(xiàn)miR-200 家族可以與E-鈣黏連蛋白轉(zhuǎn)錄抑制物ZEB1 和ZEB2 直接結(jié)合，并證實(shí)miR-200 家族可以通過上調(diào)E-鈣黏連蛋白表達(dá)量抑制EMT 的發(fā)生。然而miR-200 家族是否對(duì)Slug 也有靶向調(diào)控能力，到目前為止還未見相關(guān)報(bào)道。在ER、PR 和Her2 陽性的乳腺癌組織中，miR-200 家族高表達(dá)，而在高侵襲性的basal-like型乳腺癌組織中表達(dá)較低［8］。因此，E-鈣黏連蛋白轉(zhuǎn)錄抑制物Slug 或許是miR-200 家族抑制EMT 的另一個(gè)下游靶蛋白。

E-鈣黏連蛋白的丟失與腫瘤EMT 的發(fā)生密切相關(guān)，E-鈣黏連蛋白缺乏可以使腫瘤細(xì)胞表面粘著性降低，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，使其從有高黏附功能的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有低黏附功能的間質(zhì)細(xì)胞［9，13］。已有研究表明:Slug 是鋅指蛋白snail 家族的一員［7］，可以通過靶向結(jié)合E-鈣黏連蛋白啟動(dòng)子的E 盒，抑制E-鈣黏連蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［14，15］。本研究Real-time PCR 和Western blot 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-200c 的乳腺癌細(xì)胞系BT549 中，Slug 的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 轉(zhuǎn)染組明顯降低，而E-鈣黏連蛋白的表達(dá)則明顯升高。因此推測，在basal-like 型乳腺癌細(xì)胞系BT549 中，miR-200c 或許可以通過抑制鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白Slug 來消除其對(duì)E-鈣黏連蛋白的抑制作用，最終抑制EMT 的發(fā)生。

除了發(fā)現(xiàn)miR-200c 具有抑制Slug 的功能之外，通過進(jìn)行Transwell 遷移試驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-200c 的乳腺癌BT549 細(xì)胞的遷移能力相比未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miR-control 組中的細(xì)胞明顯下降。這說明在細(xì)胞水平上，miR-200c 有可能通過結(jié)合Slug，促進(jìn)E-鈣黏連蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制乳腺癌BT549 細(xì)胞EMT 的發(fā)生，最終抑制了乳腺癌BT549 細(xì)胞的遷移能力。

本研究結(jié)果完善了miR-200 家族在乳腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控過程中一個(gè)重要的功能學(xué)意義。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展包含眾多生物學(xué)功能的改變，其中遷移能力是極為重要的因素之一，關(guān)系到腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。然而，miR-200c 調(diào)節(jié)Slug 的具體機(jī)制，還有待實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究。

［1］吳在德，吳肇漢.外科學(xué)［M］.第7 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:508.

［2］Goldhirsch A，Wood WC，Coates AS，et al.Strategies for subtypesdealing with the diversity of breast cancer:highlights of the stgallen international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011［J］.Ann Oncol，2011，22 (8):1736-1747.

［3］Daniela Schwarzenbacher，Marija Balic，Martin Pichler，et al.The role of microRNAs in breast cancer stem cells［J］.Int J Mol，2013，14(7):14712-14723.

［4］Wang Y，Zhou BP.Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis［J］.Chin J Cancer，2011，30(9):603-611.

［5］Fu J，Rodova M，Nanta R，et al.NPV-LDE-225 (Erismodegib)inhibits epithelial mesenchymal transition and self-renewal of glioblastoma initiating cells by regulating miR-21，miR-128，and miR-200［J］.Neuro Oncol，2013，15(6):691-706.

［6］Liu YN，Yin JJ，Abou-Kheir W，et al.MiR-1 and miR-200 inhibit EMT via Slug-dependent and tumorigenesis via Slug-independent mechanisms［J］.Oncogene，2013，32(3):296-306.

［7］Castilla Má，Díaz-Martín J，Sarrió D，et al.MicroRNA-200 family modulation in distinct breast cancer phenotypes［J］.PLos One，2012，7(10):e47709.

［8］Creighton CJ，Gibbons DL，Kurie JM，et al.The role of epithelialmesenchymal transition programming in invasion and metastasis:a clinical perspective［J］.Cancer Manag Res，2013，5:187-195.

［9］Díaz-López A，Moreno-Bueno G，Cano A，et al.Role of microRNA in epithelial to mesenchymal transition and metastasis and clinical perspectives［J］.Cancer Manag Res，2014，6:205-216.

［10］Enkhbaatar Z，Terashima M，Oktyabri D，et al.KDM5B histone demethylase controls epithelial-mesenchymal transition of cancer cells by regulating the expression of the microRNA-200 family［J］.Cell Cycle，2013，12(13):2100-2112.

［11］Yu Y，Wu J，Guan L，et al.Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family［J］.Int J Cancer，2013，133(6):1368-1379.

［12］Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al .The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the Ecadherin repressors ZEB1 and ZEB2［J］.Genes Dev，2008，22(7):894-907.

［13］Thiery JP，Acloque H，Huang RY，et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease［J］.Cell，2009，139(5):871-890.

［14］Hajra KM，Chen DY，F(xiàn)earon ER，et al.The SLUG zinc-finger protein represses E-cadherin in breast cancer［J］.Cancer Res，2002，62(6):1613-1618.

［15］龍方懿，印國兵，劉智敏，等.HIF-1α、MT、Slug 和E-cadherin在人乳腺癌中的表達(dá)及其意義［J］.中國免疫學(xué)雜志，2012，18(6):502-506.