丁陳波 馮繼紅 楊麗文 李龍梅 李姍姍 陳 超 羅軍敏

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，遵義 563003)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增高，且死亡率在所有消化道腫瘤中增長最快。快的增長率和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其生存率降低的兩大主要原因，抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡可以達(dá)到降低死亡率的目的。支架蛋白Gab2(Grb2-associated binding protein 2)作為Gabs 家族蛋白(Grb2-associated binder family proteins)最主要成員之一，在細(xì)胞增殖、遷移及凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用［1，2］。近年研究表明，Gab2 在多數(shù)人類惡性腫瘤中表達(dá)增高，且Gab2 過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Gab2 在直腸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。本研究在此基礎(chǔ)上應(yīng)用慢病毒載體感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480，初步觀察Gab2 過表達(dá)后對SW480 增殖和遷移能力的影響，從而在細(xì)胞水平闡明Gab2 的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫;Leibovitz's L-15 (L-15)培養(yǎng)基購自Gibco 公司;胎牛血清購自Hyclone 公司;含Gab2基因過表達(dá)的重組慢病毒顆粒由Cyagen 公司包被完成;Gab2 兔抗人單克隆抗體購自O(shè)riGene 公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、β-actin 小鼠抗人單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體、ECL 發(fā)光液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天公司;全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司;Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度。取對數(shù)生長期的SW480 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長融合約75%左右時(shí)，按慢病毒感染說明書進(jìn)行感染。共分為3 組:以Gab2 基因過表達(dá)重組慢病毒顆粒(LV-Gab2-GFP)和對照慢病毒顆粒(LV-GFP)分別感染人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)和陰性對照組(LV-GFP 組)，空白對照組細(xì)胞不作任何處理，常規(guī)培養(yǎng)。感染條件:每孔1 ml 培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，109TU/ml 病毒液(10 μl)，polybrene 5 μg，感染8 h 后倒去培養(yǎng)基，加入2 ml 完全培養(yǎng)基，48 h 后更換完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察感染效率。大量擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細(xì)胞Gab2 mRNA 的表達(dá) 按照Trizol 說明書方法提取各組細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 循環(huán)擴(kuò)增。Gab2 上游引物:5'-GTGGGGGATCTGAATGTTTTTATG-3'，下游引物:5'-GCCCCAGGGTAGAATGAAACG-3';內(nèi)參GAPDH 上游引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;45 個(gè)循環(huán)，95℃20 s，60℃1 min;72℃延伸5 min。運(yùn)用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA 的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 Western blot 檢測細(xì)胞Gab2 蛋白的表達(dá) 以細(xì)胞裂解液裂解提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白含量。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜1.5 h，5% BSA 封閉1 h 后，分別加入Gab2 兔抗人單克隆抗體(1∶1 000)及β-actin 小鼠抗人單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜漂洗，加二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h 滴加發(fā)光試劑暗室曝光顯示條帶。

1.2.4 CCK-8 法檢測3 組細(xì)胞增殖的變化 參照CCK-8 試劑說明進(jìn)行。分別取上述3 組細(xì)胞以4 ×103/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)，37℃、5% 的CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，加入10 μl CCK-8 繼續(xù)孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下檢測各孔的吸光度值。每隔24 h 檢測一次，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將3 組細(xì)胞接種至6 孔板(400 個(gè)/孔)，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)15 d，終止培養(yǎng)后常規(guī)以PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，甲醛固定15 min，采用結(jié)晶紫染液染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)＞50 個(gè)的細(xì)胞克隆，計(jì)算克隆形成率:克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將3 組細(xì)胞以每孔1 ×105接種于24 孔板中，放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，取一無菌1 ml 槍頭用其尖端分別在24 孔板各組細(xì)胞上垂直劃痕。PBS 清洗細(xì)胞去除劃下的細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h 后倒置相差顯微鏡下觀察劃痕中細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染SW480 細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察感染效果 慢病毒載體感染SW480 細(xì)胞48 h 后，通過熒光強(qiáng)度判斷感染效果。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，感染后大部分細(xì)胞均有GFP 表達(dá)，感染效率達(dá)70%以上(圖1)。

2.2 Gab2 mRNA 在3 組細(xì)胞中的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)的Gab2 mRNA 表達(dá)較另外兩組明顯增強(qiáng)，而陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組的Gab2 mRNA 表達(dá)均很弱，且兩組間無明顯差異性(圖2A)。

2.3 Gab2 蛋白在3 組細(xì)胞中的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)較陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組Gab2 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，而陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組無顯著差異性(圖2B)。

2.4 Gab2 過表達(dá)對SW480 增殖的影響

2.4.1 CCK-8 檢測結(jié)果 培養(yǎng)24 h 時(shí)，3 組細(xì)胞的增殖速度均無明顯差異性(P ＞0.05);從48 h 到72 h 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)的細(xì)胞增殖速度均明顯高于另外兩組(P＜0.05)，而陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖速度均無明顯差異性(P ＞0.05)(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gab2 過表達(dá)能夠增強(qiáng)SW480 細(xì)胞的增殖能力。

圖1 慢病毒感染SW480 細(xì)胞熒光表達(dá)情況Fig.1 Lentivirus infection of SW480 cells and GFP expression

圖2 RT-PCR 和Western blot 檢測Gab2 在SW480 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of Gab2 in SW480 cells were detected by RT-PCR and Western blot

圖3 Gab2 過表達(dá)對SW480 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of Gab2 overexpression on proliferation of SW480 cells

圖4 Gab2 過表達(dá)對SW480 細(xì)胞克隆形成的影響Fig.4 Effects of Gab2 overexpression on clone formation of SW480 cells

圖5 Gab2 過表達(dá)對SW480 細(xì)胞遷移能力的影響(SP，×40)Fig.5 Effects of Gab2 overexpression on migration of SW480 cells(SP，×40)

2.4.2 單細(xì)胞克隆形成結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)細(xì)胞克隆形成率(85.10 ±5.38)%明顯高于陰性對照組(LV-GFP 組)細(xì)胞克隆形成率(51.13±10.46)%和空白對照組細(xì)胞克隆形成率(53.43±8.79)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組之間差異不顯著(P ＞0.05)(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gab2 過表達(dá)能夠增強(qiáng)SW480 細(xì)胞克隆形成的能力。

2.5 Gab2 過表達(dá)對SW480 細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(LV-Gab2-GFP 組)細(xì)胞遷移能力較另外兩組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組差異不明顯(P ＞0.05)(圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gab2 過表達(dá)能夠增強(qiáng)SW480 細(xì)胞的遷移能力。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)居全球癌癥的第4 位［4］。盡管目前治療手段多樣，但療效不盡人意，快的增長率和重要臟器的轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。因此，與結(jié)直腸癌增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志是目前結(jié)直腸癌研究的熱點(diǎn)問題。

Gabs 家族蛋白(Grb2-associated binder family proteins)是一類廣泛表達(dá)的支架蛋白，該家族成員包括哺乳動物內(nèi)Gab1～Gab4，果蠅屬DOS，海葵內(nèi)Ne-Gab 及秀麗線蟲內(nèi)Soc1［1］。Gab2 作為Gabs 家族的重要成員之一，主要介導(dǎo)SHP2/ERK 途徑和PI3K/AKT 途徑，對細(xì)胞增殖、分化、粘附及遷移等生物學(xué)功能至關(guān)重要［1］。近些年來，隨著對Gab2研究的不斷深入，Gab2 在多種惡性腫瘤中所發(fā)揮的作用正逐漸被揭示，Gab2 可能作為一種致癌基因，在不同的腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。在乳腺癌中，Gab2 蛋白和ErbB2 (Neu，HER2)表達(dá)同時(shí)增高時(shí)，通過Gab2 介導(dǎo)的SHP2/ERK 信號通路提高乳腺腫瘤的惡性程度及腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［5］。Wohrle等［6］發(fā)現(xiàn)，Gab2 通過SHP2/RAS/ERK 及PI3K/AKT/mTOR 信號通路，可以增強(qiáng)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞的增殖和存活能力，而敲除Gab2 基因會明顯抑制細(xì)胞增殖和存活。另外，在NRAS 突變誘導(dǎo)的黑色素瘤中，Gab2 通過激活RAS/ERK 信號通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖及腫瘤血管的生成［7］。研究表明，在卵巢癌中通過激活PI3K/Zeb1通路，Gab2 過表達(dá)啟動了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelialto-mesenchymal transition，EMT)程序，抑制了E-ca的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力［8］。Dunn 等［9］也發(fā)現(xiàn)，Gab2 可以作為卵巢癌的一種致癌基因，可通過活化PI3K 信號途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變。除此之外，Gab2 在肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及胃癌中表達(dá)異常，并與腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)［10-12］。

本研究通過Gab2 基因的重組慢病毒顆粒(LVGab2-GFP)感染人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞，觀察Gab2過表達(dá)對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)LV-Gab2-GFP 慢病毒載體能夠被高效的感染SW480 細(xì)胞，并在SW480 細(xì)胞過表達(dá)Gab2 mRNA和蛋白。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，過表達(dá)Gab2 的SW480 細(xì)胞增殖和遷移能力顯著增強(qiáng)。提示Gab2在人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，但Gab2 促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制需要作進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，Gab2 在人類多種惡性腫瘤的增殖、遷移及浸潤過程中扮演了重要角色。本研究初步證實(shí)了Gab2 過表達(dá)能夠促進(jìn)人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞增殖和克隆形成，并增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。這些提示Gab2 可能作為一個(gè)新的結(jié)直腸癌的癌基因被用于結(jié)直腸癌的早期診斷與治療，也為進(jìn)一步研究Gab2的生物學(xué)功能及其作用分子機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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