潘興元 陳則東 竇 延 梁 鍇 余鳴鳴 季明春

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，揚(yáng)州 225001)

1 型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1D)是由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，以胰島β 細(xì)胞損傷為主要特征的器官特異性自身免疫疾病，目前仍無(wú)有效的根治方法［1］。非肥胖型糖尿病小鼠(Nonobese diabetic，NOD)能自然發(fā)生1 型糖尿病，從12 周齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀，至30 周齡時(shí)雌性小鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)到80%。并且與人類(lèi)似，在疾病早期(4～5周齡)發(fā)生胰島炎，進(jìn)行性破壞胰島β 細(xì)胞，是目前研究1 型糖尿病的主要?jiǎng)游锬Ｐ椭唬?，3］。

在NOD 小鼠1 型糖尿病病程中，CD8+細(xì)胞毒T 細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)發(fā)揮著重要作用［4］，特別是啟動(dòng)抗原胰島素(insulin)特異性的CTLs 更是研究熱點(diǎn)之一［1］。insulin B15-23(簡(jiǎn)寫(xiě)為InsB15-23)是H-2Kd限制性的優(yōu)勢(shì)表位［5］，但它與H-2Kd的親和力很低。為了研究InsB15-23表位在T1D病程中的作用，我們引入了二硫鍵陷阱單鏈三聚體(disulfide trap single chain trimer，dtSCT)技術(shù)［6，7］，來(lái)提高InsB15-23的穩(wěn)態(tài)肽占位水平(level of steadystate peptide occupancy)。我們用前期構(gòu)建的膜表達(dá)型InsB15-23H-2KddtSCT (簡(jiǎn)寫(xiě)為InsB15-23mdtSCT)真核表達(dá)載體皮下免疫3 周齡母鼠，觀(guān)察其對(duì)NOD小鼠血糖和發(fā)病情況的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠 3 周齡SPF 級(jí)NOD/ShiLtJ 雌性小鼠購(gòu)自南京大學(xué)國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)，在SPF 條件下飼養(yǎng)，所用飼料、飲水與墊料均經(jīng)高壓滅菌處理，實(shí)驗(yàn)所有操作均在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。操作都符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.2 免疫小鼠 24 只3 周齡的NOD 母鼠隨機(jī)分為兩組，每組12 只。實(shí)驗(yàn)組小鼠首免使用50 μg InsB15-23mdtSCT 加等體積的弗氏完全佐劑，接種于NOD 小鼠右后肢外側(cè)皮下;1 周以后，用50 μg InsB15-23mdtSCT 加等體積的弗氏不完全佐劑，于相同部位行第二次免疫;距二次免疫后一周進(jìn)行第三次免疫，方法與第二次接種相同。對(duì)照組采用pcDNA3.1(-)空載體，方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.3 NOD 小鼠的血糖監(jiān)測(cè) 從10 周齡開(kāi)始，采用三諾公司的安穩(wěn)血糖儀檢測(cè)小鼠血糖，每周監(jiān)測(cè)一次，直到30 周。每次檢測(cè)前對(duì)NOD 小鼠行6 h 的禁食處理，并更換墊料，防止小鼠采食食物殘?jiān)鼘?duì)血糖測(cè)定值造成干擾。

1.4 胰島單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)分析 取3 周齡的NOD母鼠4 只，隨機(jī)分為兩組，同法免疫。7 周齡時(shí)處死小鼠，取胰腺制成石蠟切片。取連續(xù)切片置于顯微鏡下觀(guān)察，分別統(tǒng)計(jì)0～1/4 浸潤(rùn)、1/4～1/2 浸潤(rùn)、1/2～3/4 浸潤(rùn)、3/4～完全浸潤(rùn)的胰島個(gè)數(shù)，并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚體的制備 胰島細(xì)胞特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(Islet glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein，IGRP)是1 型糖尿病病程晚期的重要抗原，其H-2Kd限制性表位是IGRP206-214［1］。為了研究InsB15-23mdtSCT 分子影響1 型糖尿病病程的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，我們制備了IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚體來(lái)監(jiān)測(cè)NOD 小鼠IGRP206-214特異性CTLs 的變化。方法參照本實(shí)驗(yàn)室可溶性dtSCT 四聚體制備方法。簡(jiǎn)而言之就是通過(guò)SOE-PCR 將InsB15-23抗原肽、β2m和H-2Kd胞外區(qū)依次相連，并在H-2Kd的84 位引入一個(gè)酪氨酸-半胱氨酸(Y84C)突變，與linker1 中的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵，幫助抗原肽更好地與抗原結(jié)合槽結(jié)合［8］。同時(shí)在H-2Kd胞外區(qū)3'端加上可生物素化Avitag(GGGLNDIFEAQKIEWHE)序列［9］，在5'端和3'端分別加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，克隆入pET-22b 原核表達(dá)載體中。經(jīng)過(guò)原核表達(dá)、洗滌包涵體、純化包涵體、稀釋復(fù)性得到IGRP206-214H-2KddtSCT 單體，再將單體生物素化后與PE 熒光素標(biāo)記的streptavidin 按4∶1比例混合制備成四聚體。

1.6 流式檢測(cè) 先標(biāo)記APC-mCD8α 單抗，再標(biāo)記IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚體。用含有0.5%FBS的PBS 洗3 次后在BD Calibur 上進(jìn)行檢測(cè)。同周齡的BALB/c 小鼠作為陰性對(duì)照來(lái)檢測(cè)非特異性標(biāo)記水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 InsB15-23mdtSCT 能夠降低NOD 小鼠T1D 的發(fā)病率 因?yàn)閷?shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，期間有部分小鼠意外死亡，統(tǒng)計(jì)最終結(jié)果時(shí)InsB15-23mdtSCT 組還剩11 只，pcDNA3.1(-)組還剩10 只。由圖1A 可見(jiàn)，30 周齡時(shí)兩組小鼠的平均血糖有顯著差異(P ＜0.05)，InsB15-23mdtSCT 組中91%(10/11)NOD 小鼠的血糖值低于閾值(13.9 mmol/dl，即250 mg/L)，而pcDNA3.1(-)組這一比例僅40%(4/10)。由圖1B 可見(jiàn)，InsB15-23mdtSCT 組NOD 小鼠的發(fā)病率是9%，顯著低于pcDNA3.1(-)組的60%和自然發(fā)病組的80%。由此可見(jiàn)InsB15-23mdtSCT 具有保護(hù)NOD 小鼠，降低其糖尿病發(fā)生率的作用。

2.2 過(guò)表達(dá)InsB15-23mdtSCT 降低NOD 小鼠胰島浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 我們通過(guò)連續(xù)切片的方法，系統(tǒng)地檢查NOD 小鼠每個(gè)胰島的浸潤(rùn)情況，發(fā)現(xiàn)InsB15-23mdtSCT 處理組的細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低，0～1/4 浸潤(rùn)胰島的比率明顯多于pcDNA3.1(-)組;而1/4～1/2、1/2～3/4、3/4～1 浸潤(rùn)胰島的比率均顯著減少(圖2)。由此可見(jiàn)InsB15-23rndtSCT 具有減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)胰島的作用。

圖1 30 周齡時(shí)NOD 小鼠的血糖及發(fā)病率Fig.1 Blood sugar value and morbidity of NOD mice in 30 weeks

圖2 胰島浸潤(rùn)情況Fig.2 Infiltration of islets

圖3 InsB15-23mdtSCT 過(guò)表達(dá)對(duì)NOD 小鼠外周血IGRP206-214特異性CTLs 頻率無(wú)影響Fig.3 Overexpression of InsB15-23mdtSCT does not influence frequency of IGRP206-214specific CTLs in PBMC

2.3 InsB15-23mdtSCT 通過(guò)IGRP206-214非依賴(lài)性途徑來(lái)保護(hù)NOD 小鼠 在1 型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中存在著抗原表位擴(kuò)展的現(xiàn)象［4］，因此針對(duì)上游的抗原進(jìn)行免疫干預(yù)，勢(shì)必會(huì)干擾到下游抗原的暴露，進(jìn)而影響到相應(yīng)抗原特異性CTLs 的水平和疾病的發(fā)展。InsB15-23特異性CTLs 大約在4～5 周齡時(shí)最多［10，11］，是T1D 進(jìn)程中起始抗原特異性CTLs，數(shù)量較少;而IGRP206-214特異性CTLs 是目前發(fā)現(xiàn)的1 型糖尿病后期的重要自身反應(yīng)性CTLs，往往就在發(fā)生糖尿病前達(dá)到高峰［12］。那么InsB15-23mdtSCT對(duì)NOD 小鼠的保護(hù)作用是通過(guò)影響IGRP206-214特異性CTLs 水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的嗎?我們發(fā)現(xiàn)16 周齡、40 周齡的NOD 小鼠外周血中IGRP206-214特異性CTLs 的頻率都和pcDNA3.1(-)組均無(wú)顯著差異，但都與陰性對(duì)照BALB/c 有顯著或極顯著差異(圖3)，說(shuō)明我們自制的四聚體是有效的，并且InsB15-23mdtSCT 是通過(guò)IGRP206-214非依賴(lài)性機(jī)制來(lái)保護(hù)NOD小鼠的。

3 討論

NOD 小鼠飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室的IVC 籠盒中，嚴(yán)格按照IVC 操作規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)管理。在交配繁殖工作中，通過(guò)血糖測(cè)定選取血糖值明顯偏高的小鼠進(jìn)行交配繁殖，防止糖尿病性狀的丟失。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室截止至30 周齡的NOD 小鼠分析發(fā)現(xiàn)，母鼠的發(fā)病率為80%，公鼠的發(fā)病率為22.2%，與美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室公布的數(shù)據(jù)基本一致。

CTLs 在NOD 小鼠1 型糖尿病病程中有著重要作用，β2mnullNOD 小鼠不表達(dá)MHCⅠ類(lèi)分子，CTLs缺失，結(jié)果完全不發(fā)生1 型糖尿病，甚至連胰島炎都100%不發(fā)生［13，14］。有報(bào)道表明CTLs 在1 型糖尿病除了晚期的各個(gè)時(shí)期都是必需的，尤其對(duì)NOD 小鼠早期疾病的引發(fā)以及自身反應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞的擴(kuò)增是必不可少的［15，16］。在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種自身抗原，存在表位擴(kuò)展的現(xiàn)象。其中胰島素作為疾病進(jìn)程中早期的關(guān)鍵性抗原，對(duì)于其他抗原的暴露及相應(yīng)CTLs 的誘導(dǎo)有著關(guān)鍵作用。用編碼preproinsulinⅡ、proinsulinⅡ、insulinⅡ的質(zhì)粒免疫NOD 小鼠，都可以加速T1D 的發(fā)?。?7］，所以我們將關(guān)注點(diǎn)集中在胰島素特異性CTLs，也就是InsB15-23特異性、H-2Kd限制性CTLs 上，研究其在1型糖尿病病程中的作用。

以往這方面的研究往往用流式分選出InsB15-23特異性CTLs，再過(guò)繼轉(zhuǎn)移給NOD·SCID 小鼠或經(jīng)半致死劑量輻照的NOD 幼齡小鼠［5］，因?yàn)槭荏w小鼠都是免疫缺陷的，并且是將CTLs 單獨(dú)過(guò)繼給受體小鼠，所以這種方法不是嚴(yán)格的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，不能反映NOD 小鼠體內(nèi)的真實(shí)情況。還有一種常用的方法是用人工合成的InsB15-23肽來(lái)免疫NOD 小鼠。這種方法較為簡(jiǎn)便，但合成肽存在純度問(wèn)題，哪怕是99.9%純度的肽中也必然混有其他抗原肽，而其中一些強(qiáng)免疫原性的痕量雜肽就有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果［18］?；谝陨峡紤]，我們決定用真核表達(dá)質(zhì)粒來(lái)免疫動(dòng)物。因?yàn)镮nsB15-23肽的低親和力，我們采用dtSCT 技術(shù)來(lái)提高肽與H-2Kd分子抗原結(jié)合槽的親和力。

DNA 疫苗最常用的免疫途徑是肌肉免疫。肌肉組織里抗原遞呈細(xì)胞極少，主要是肌細(xì)胞攝取并表達(dá)抗原，但肌細(xì)胞缺乏共刺激分子，在誘導(dǎo)CTLs應(yīng)答中并不起直接作用，而是合成抗原并通過(guò)某種方式釋放到細(xì)胞外，供抗原遞呈細(xì)胞攝取(交叉激活)［19］。我們的dtSCT 分子在細(xì)胞內(nèi)“預(yù)裝配”，需要直接表達(dá)，而不是經(jīng)過(guò)加工遞呈，所以我們選擇了皮下免疫。

因?yàn)閐tSCT 分子在細(xì)胞內(nèi)“預(yù)裝配”，有效地繞過(guò)細(xì)胞對(duì)抗原處理和提呈過(guò)程中的各種限制，可以提高抗原提呈的效率，展示出了活化CTLs 的良好前景［20］。本實(shí)驗(yàn)室前期的工作也發(fā)現(xiàn)InsB15-23mdtSCT 分子能夠在真核細(xì)胞膜表面展示，并可以提高NOD 小鼠外周血和脾臟中InsB15-23特異性CTLs的頻率(另文發(fā)表)，所以我們初始的預(yù)期是InsB15-23mdtSCT 真核表達(dá)載體會(huì)加速疾病的進(jìn)程。然而，在本研究中卻發(fā)現(xiàn)InsB15-23mdtSCT 具有降低NOD 小鼠1 型糖尿病發(fā)病率的作用。我們檢查了胰島浸潤(rùn)情況，發(fā)現(xiàn)免疫InsB15-23mdtSCT 的NOD 小鼠胰島單個(gè)核細(xì)胞的浸潤(rùn)確實(shí)減輕了。這可能由于我們構(gòu)建的InsB15-23mdtSCT 是由強(qiáng)啟動(dòng)子CMV 控制的，免疫動(dòng)物后短期內(nèi)能產(chǎn)生過(guò)量的抗原信號(hào)，導(dǎo)致CTLs 的活化后凋亡，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。并且，我們還發(fā)現(xiàn)InsB15-23mdtSCT 對(duì)小鼠的保護(hù)作用并不是通過(guò)IGRP206-214依賴(lài)性機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用的，具體的機(jī)制很值得我們深入研究。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1(-)對(duì)照組的發(fā)病率略低于自然發(fā)病率，這可能是由于弗氏完全佐劑對(duì)NOD 小鼠免疫系統(tǒng)的干預(yù)引起的［21］。但在我們的實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠初次免疫都使用了弗氏完全佐劑，對(duì)小鼠的影響是相同的，兩組小鼠發(fā)病率的差異是由于免疫不同的真核表達(dá)質(zhì)粒造成的。

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