王國(guó)戧 王小方 汪 磊 張華麗 仲 華 潘亞晶 張 磊 婁婷葉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，衛(wèi)輝 453100)

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在各種各樣的外界環(huán)境中形成的一種最普遍的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌生物膜形成是對(duì)外界環(huán)境壓力的一種反應(yīng)，細(xì)菌形成生物膜后對(duì)外界的不利環(huán)境因素產(chǎn)生了抗性，包括對(duì)抗生素和宿主的免疫力［1］。細(xì)菌形成生物膜感染機(jī)體后引起感染的慢性化這一觀點(diǎn)已經(jīng)形成廣泛共識(shí)［2-5］。關(guān)于細(xì)菌生物膜感染機(jī)體后引發(fā)的免疫反應(yīng)目前報(bào)道的較少［6，7］，在這些少有的報(bào)道中，有文獻(xiàn)認(rèn)為細(xì)菌生物膜感染刺激了Th17 細(xì)胞增殖和IL-17 細(xì)胞因子的表達(dá)增加［8-11］，但是也有報(bào)道稱生物膜并沒(méi)有引起機(jī)體明顯的免疫反應(yīng)［12］，鑒于此，本研究的目的是研究生物膜形成能力和Th17 細(xì)胞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)中所用菌株 實(shí)驗(yàn)中所用的銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌來(lái)自于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床肺泡灌洗液標(biāo)本(細(xì)菌由肺泡灌洗液中培養(yǎng)分離)中第一代分離菌株(細(xì)菌在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)檢測(cè)生物膜形成能力)。

1.1.2 儀器和試劑 儀器:流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司(FACS Canto)、酶免儀為煙臺(tái)艾德康公司生產(chǎn)全自動(dòng)酶免疫工作站;試劑:Biolegend 公司人Th17流式檢測(cè)試劑盒:包括FITC 標(biāo)記的抗人CD3，PE 標(biāo)記的抗人CD4，Alexa Fluor 647 標(biāo)記的抗人IL-7 及相匹配的鼠IgG1 同型對(duì)照，固定液和破膜洗液;Biolegend 公司CD4+CD25+Foxp3+Treg 一步法流式檢測(cè)試劑盒:包括FITC 標(biāo)記的抗人CD4，PE 標(biāo)記的抗人CD25，Alexa Fluor647 標(biāo)記的Foxp3 及相匹配的鼠IgG1 同型對(duì)照，F(xiàn)oxp3+固定/破膜液和破膜緩沖液;佛波酯、離子霉素均購(gòu)自Sigma 公司;莫能霉素購(gòu)自Biolegend 公司;IL-17ELSIA 試劑盒為Biosource公司生產(chǎn)，結(jié)晶紫染液為自行配置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IL-17 的檢測(cè) 臨床上無(wú)菌手續(xù)采集的肺泡灌洗液通過(guò)4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾注入10 ml 的無(wú)菌試管中，2 000 r/min 離心5 min，上清液用于IL-17 的檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，離心沉淀用于細(xì)菌培養(yǎng)和Th17 細(xì)胞的檢測(cè)，2013 年1 月至2013年12 月共收到肺泡灌洗液標(biāo)本253 例，另外檢測(cè)病人以及健康對(duì)照人群的外周血清IL-17 水平。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 上述離心后的肺泡灌洗液標(biāo)本無(wú)菌手續(xù)取出少許用于細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定，剩余標(biāo)本用于Th17 細(xì)胞的檢測(cè)，沉淀標(biāo)本接種于血瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)平板，次日將單個(gè)菌落用于細(xì)菌鑒定和生物膜形成能力的檢測(cè)(依據(jù)細(xì)菌菌落和細(xì)菌形態(tài)特點(diǎn)初步判斷銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的菌落用于檢測(cè)生物膜形成能力，經(jīng)鑒定后不是上述兩種細(xì)菌的生物膜形成能力檢測(cè)結(jié)果剔除)。

1.3 細(xì)菌生物膜形成能力的檢測(cè) 用結(jié)晶紫染色法［13］對(duì)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌進(jìn)行生物被膜生成能力檢測(cè)。具體方法如下:用細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管將鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌菌液調(diào)節(jié)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，?0 μl 加入96 孔平底組織培養(yǎng)板中(每孔含200 μl 的1∶50 稀釋的LB 培養(yǎng)液)。每株菌作3 個(gè)復(fù)孔，一個(gè)空白對(duì)照孔只加培養(yǎng)液，37℃靜止培養(yǎng)48 h;每個(gè)菌的3 個(gè)復(fù)孔中分別加入150 μl 0.25 g/L 的結(jié)晶紫染液，室溫下染色20 min;生理鹽水沖洗5 次后晾干;每孔加入95%乙醇300 μl，室溫脫色10 min;用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)每孔脫色液在570 nm 處的吸光度值(A570)。每個(gè)菌的A570 等于其3 個(gè)復(fù)孔的A570 的平均值減去空白對(duì)照孔A570 值。

1.4 Th17 細(xì)胞的檢測(cè) Th17 細(xì)胞的檢測(cè)嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行，檢測(cè)對(duì)象為上述培養(yǎng)出銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的肺泡灌洗液標(biāo)本以及上述病人的外周血以及24 例健康人外周血的Th17細(xì)胞。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)均數(shù)均采用±s 表示，各組間均數(shù)差異統(tǒng)計(jì)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和配對(duì)資料的t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果 共分離培養(yǎng)出銅綠假單胞菌59 例，鮑曼不動(dòng)桿菌54 例，這兩種細(xì)菌共計(jì)113 例。

2.2 細(xì)菌生物膜形成能力檢測(cè)結(jié)果 113 株細(xì)菌的生物被膜形成能力檢測(cè)結(jié)果為A570 值的最大分布范圍為:0.15～2.12，其中A570 值0.5 以下24株，A570 值1.5 以上28 份。在此本研究將A570 值0.5 以下的24 株細(xì)菌定為弱生物膜形成菌，感染此菌的病人定為非生物膜感染組，A570 值1.5 以上的28 株菌定為強(qiáng)生物膜形成菌，感染此菌的病人定為生物膜感染組。

2.3 生物膜感染組和非生物膜感染組Th17 細(xì)胞和IL-17 水平

2.3.1 不同實(shí)驗(yàn)組外周血Th17 細(xì)胞和血清IL-17水平比較，見(jiàn)表1。

Th17 細(xì)胞三組之間比較P ＞0.05，分別為生物膜感染組對(duì)非生物膜感染組P=0.409，對(duì)健康對(duì)照組P=0.779，非生物膜感染組對(duì)健康對(duì)照P=0.598，血清IL-17 水平三組之間比較P ＞0.05，分別為生物膜感染組對(duì)非生物膜感染組P=0.138，對(duì)健康對(duì)照組P=0.136，非生物膜感染組對(duì)健康對(duì)照P=0.992。

2.3.2 不同實(shí)驗(yàn)組支氣管灌洗液Th17 細(xì)胞和IL-17水平比較(±s)，見(jiàn)表2 以及流Th17 細(xì)胞式細(xì)胞圖(圖1)。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組外周血Th17 細(xì)胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.1 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in peripheral blood in different experimentation groups(±s)

表1 不同實(shí)驗(yàn)組外周血Th17 細(xì)胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.1 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in peripheral blood in different experimentation groups(±s)

表2 不同實(shí)驗(yàn)組支氣管灌洗液Th17 細(xì)胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.2 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in bronchus alveolus washing-water between bio-film infection and Non bio-film infection group±s)

表2 不同實(shí)驗(yàn)組支氣管灌洗液Th17 細(xì)胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.2 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in bronchus alveolus washing-water between bio-film infection and Non bio-film infection group±s)

圖1 生物膜感染組與非生物膜感染組支氣管灌洗液中Th17 細(xì)胞流式細(xì)胞圖Fig.1 Flow cytometry pictures of Th17 cell in bronchoalveolar lavage fluid

3 討論

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在外界環(huán)境壓力下形成的一種普遍的結(jié)構(gòu)，是對(duì)外界壓力的一種適應(yīng)性反應(yīng)。細(xì)菌形成生物膜后對(duì)外界的抗性增加，包括對(duì)抗生素的耐藥性和對(duì)機(jī)體的免疫逃避。報(bào)道認(rèn)為細(xì)菌生物膜刺激機(jī)體并引起了機(jī)體的免疫反應(yīng)，并引起感染機(jī)體的組織損害［8］，但也有報(bào)道認(rèn)為細(xì)菌生物膜并沒(méi)有引起機(jī)體的免疫反應(yīng)［12］，有報(bào)道認(rèn)為細(xì)菌生物膜誘導(dǎo)了IL-6、IL-8 升高［2，14，15］，也有報(bào)道認(rèn)為，浮游菌相對(duì)于生物膜細(xì)菌引起機(jī)體產(chǎn)生更多的IL-6、IL-8、血管內(nèi)皮因子、TGF-β1，但生物膜細(xì)菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了更多的TNF-α［16］。

Th17 細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的隸屬于T 細(xì)胞的細(xì)胞系，在處理浮游菌細(xì)胞外感染中起關(guān)鍵作用，在慢性生物膜菌感染發(fā)生囊性纖維化或者支氣管擴(kuò)張時(shí)Th17 細(xì)胞也可能起到了關(guān)鍵作用［17］，鑒于生物膜菌感染結(jié)果引起的不一致報(bào)道，我們的研究集中在了生物膜細(xì)菌感染引起的Th17 細(xì)胞的變化。

我們的研究結(jié)果表明，生物膜感染主要引起了感染局部Th17 細(xì)胞的變化，并沒(méi)有引起全身系統(tǒng)性的免疫變化，局部Th17 細(xì)胞的聚集，Th17 細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞趨化因子引起更多的中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位［17］，中性粒細(xì)胞在殺死感染細(xì)菌的同時(shí)也引起了感染機(jī)體組織的損傷，另一方面細(xì)菌生物膜的存在導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥［18］和對(duì)機(jī)體免疫力的抵抗［19］，這可能是細(xì)菌形成生物膜后引起感染慢性化的機(jī)制，從而導(dǎo)致了感染機(jī)體的長(zhǎng)期慢性損害。所以對(duì)于生物膜細(xì)菌感染機(jī)體適當(dāng)?shù)亟档兔庖叻磻?yīng)有利于減輕感染局部的炎癥損害。關(guān)于細(xì)菌生物膜引起Th17 細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們沒(méi)有檢索到相關(guān)文獻(xiàn)，這方面的機(jī)制我們研究小組正繼續(xù)努力通過(guò)生物膜的主要成分分別研究。

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