周明澤

(北京熱景生物技術有限公司，北京100076)

上轉磷光技術(UPT)是近年來發(fā)展起來的一種具有高靈敏度，基于上轉磷光體UCP的新型生物檢測技術［1］。其中，上轉磷光顆粒是納米級的晶體顆粒，它由包埋于氧化硫等惰性材料中的稀土鑭系元素組成。其特性可由紅外線激發(fā)，而發(fā)射紅、藍、綠等不同波長的可見光［2］。磷光信號可由改進的落射顯微鏡進行觀察，并可用計算機系統(tǒng)進行檢測和分析，達到定性、定量檢測生物活性分子的目的［3］。

UCP具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性、簡易性、靈活性、安全性等獨特光學特性，使其作為新型標記物在生物檢測領域將發(fā)揮巨大的潛能。迄今為止，上轉磷光技術已被應用于免疫標記分析、免疫層析分析等多種標記檢測技術中。近年來發(fā)現(xiàn)C-反應蛋白濃度甚至在正常范圍內(nèi)的輕度升高都與心血管疾病發(fā)生的危險性增加有關，可以推測心肌梗死事件發(fā)生的可能性。超敏C-反應蛋白是心腦血管疾病中的一項獨立風險預測指標，可以敏感地預測糖尿病合并心腦血管事件的危險發(fā)生率［4］。所以CRP的定量測定至關重要。

CRP是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應的急性時相蛋白，在組織損傷、感染等刺激下，被激活的單核細胞釋放白細胞介素1(IL．1)，刺激肝細胞加速合成CRP，對炎癥感染的發(fā)生發(fā)展存在很大的相關［5－6］。筆者是在雙抗體夾心免疫分析的基礎上建立起來的檢測方法，具有反應時間短，靈敏度高，特異性、準確性、穩(wěn)定性好，無環(huán)境污染和放射危害的特點［7］。

1 材料與方法

1．1 抗體配對篩選 抗體配對篩選采用的是同時對幾組抗體標記及包被，最后相互配對來測定CRP校準品，根據(jù)試驗結果來選擇標記及包被抗體。主要利用克隆號為3B11、3C8等抗體來標記及包被，包被量按2．0 mg/ml，標記比例按mucp∶m抗體=20∶1來測定CRP校準品，最終根據(jù)測定的靈敏度、測定結果梯度及反應強度等來選擇抗體配對。

表1 抗體配對組合

1．2 反應條件的選擇 由于CRP測定過程中反應時間對測定結果有影響，為了滿足臨床快速診斷的要求，同時也要保證試劑測定的準確性及符合率，故在相同的試紙條測定相同樣本在不同時間的變化，該試驗主要是加樣孔中分別加入稀釋后的樣本100μl，室溫反應不同時間后，測量各試紙條的T/C值來平行對比。

2 結果與分析

2．1 抗體配對篩選 由圖1可知，經(jīng)過2株抗體3B11及3C8的相互配對，結果表明:①3C8標記和3B11包被測定結果靈敏度好，線性相關也很好，在抗體配對中，該標記、包被的配對情況均符合要求;②3B11標記和3C8包被測定結果靈敏度不是特別好，線性相關也不是特別好，但抗體配對仍有反應，若3C8標記與3B11配對仍無法調節(jié)到最優(yōu)，可以考慮使用此配對方案來調整;③3C8標記及3C8包被配對不成功，反應均沒有一定的梯度，高濃度仍與陰性相同;④3B11標記及3B11包被配對并不是最好，線性相關并不好，目前暫且不使用此配對。綜上分析，目前CRP測定使用3C8標記和3B11包被，可以實現(xiàn)一個較優(yōu)組合。

2．2 反應條件的選擇 由圖2可知，反應5 min時T/C值較低，線性也不夠理想，反應10～20 min時T/C值基本穩(wěn)定，線性、靈敏度也較滿意。考慮到免疫層析反應的特點，一般15 min才能完成層析過程，所以選擇15 min作為反應時間。

3 討論

上轉換發(fā)光材料的出現(xiàn)為免疫層析技術的發(fā)展提供了新的空間。自然界中所有物質的發(fā)光過程均需遵循Stokes規(guī)則，即發(fā)射光的波長長于激發(fā)光的波長［8］。

上述特點使得UCP作為生物標記物有著極為廣泛的應用前景。因而在以抗原抗體為代表(還可包括核苷酸等)的UCP標記技術平臺的基礎上，使其與免疫層析技術相結合，再利用微型化的光電子材料可以開發(fā)出一種靈敏、快速、操控簡易的免疫診斷分析儀［9］。

目前美國國防部研制的UPT儀器用于生物防恐檢測鼠疫、定量檢測炭疽芽孢，美國Orasure公司研制的UPT儀器用于檢測艾滋病病毒抗體、毒品含量定量檢測等，我國國內(nèi)科研單位如軍事醫(yī)學科學院流行病研究所楊瑞馥課題組研究該領域已經(jīng)將近10年，已經(jīng)研制成功鼠疫、O157細菌、炭疽芽孢、表面抗體定量檢測等免疫層析檢測試劑，相關文獻發(fā)表20余篇，SCI文獻發(fā)表10 余篇［10］。

4 結論

該研究主要在上轉發(fā)光技術平臺上，通過抗體篩選、反應條件的選擇來確立C-反應蛋白測定條件，建立起包被濃度2 mg/ml和反應時間15 min時，與人血清白蛋白、膽紅素等結構類似物無交叉反應，且具有反應時間短，靈敏度高，特異性、準確性、穩(wěn)定性好，無環(huán)境污染和放射危害的試劑。同時通過抗體配對篩選，3C8標記和3B11包被可以實現(xiàn)一個較優(yōu)組合，2 mg/ml的包被濃度及反應時間在15 min時，能保證T/C值，線性和靈敏度較好。

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