金 雷，陳雪昌，陳 瑜，劉 歡，郭遠(yuǎn)明

(1．浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316100;

2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100000)

樂(lè)清灣位于浙江省中南部沿海，因?yàn)闉┩棵娣e十分廣闊，加上近岸海水渾濁度大、泥質(zhì)灘涂、有機(jī)質(zhì)豐富等特點(diǎn)，是浙江省海水灘涂貝類養(yǎng)殖的主要產(chǎn)區(qū)［1-2］。其中，主要以養(yǎng)殖縊蟶(Sinonovacula constricta)、文蛤(Meretrix meretrix)、泥蚶(Tegillarca granosa)等濾食性雙殼貝類為主，其養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量均占海水灘涂貝類養(yǎng)殖總面積和產(chǎn)量的80%以上。但是，近年來(lái)隨著樂(lè)清灣地區(qū)人口密集化程度的不斷提高，生活污水排放日益增多，使得部分養(yǎng)殖海域受到不同程度污染［3-5］。

貝類不僅營(yíng)養(yǎng)豐富、滋味鮮美、價(jià)格低廉，而且富含牛磺酸，具有養(yǎng)生保健功能，因此深受消費(fèi)者的青睞。然而，雙殼貝類屬于濾食性生物，在濾食餌料生物的同時(shí)，會(huì)將水體中的微生物吸入體內(nèi)，食用病原微生物寄生的貝類極易引發(fā)疾病，從而暴發(fā)貝類中毒事件。為了保障消費(fèi)者食用貝類產(chǎn)品衛(wèi)生和安全，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局和浙江省海洋與漁業(yè)局從2008年起就對(duì)樂(lè)清灣主要貝類養(yǎng)殖海區(qū)的環(huán)境狀況以及養(yǎng)殖貝類衛(wèi)生狀況進(jìn)行了分類管理工作。筆者通過(guò)對(duì)樂(lè)清灣不同品種灘涂養(yǎng)殖貝類的微生物進(jìn)行抽樣檢測(cè)，掌握不同品種貝類對(duì)微生物富集能力的差異。同時(shí)，對(duì)貝類生長(zhǎng)環(huán)境中的水體進(jìn)行微生物檢測(cè)，確定生長(zhǎng)水體對(duì)貝類富集微生物的影響程度。最后，通過(guò)水體凈化試驗(yàn)，確定貝類微生物含量的增減規(guī)律。

1 材料與方法

1．1 采樣站位的設(shè)置 選擇樂(lè)清灣沿岸主要的海水灘涂貝類養(yǎng)殖區(qū)作為監(jiān)測(cè)位點(diǎn)，共設(shè)置15個(gè)監(jiān)測(cè)位點(diǎn)，其中溫嶺市5個(gè)，玉環(huán)縣5個(gè)，樂(lè)清市5個(gè)，具體監(jiān)測(cè)位點(diǎn)如圖1所示。

1．2 主要儀器 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)GHP-9270);智能光照培養(yǎng)箱(型號(hào)GXZ);生物安全柜(型號(hào)BSC-1000ⅡA2);立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào)YXQ-LS-50G);其他實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1．3 培養(yǎng)基及試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、EC肉湯(E．coli broth)、伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂、2216E瓊脂和HBI生化鑒定試劑盒等，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;其余均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

暫養(yǎng)的海水購(gòu)自舟山市普陀區(qū)東河市場(chǎng)。海水理化特性如下:水溫24 ℃，pH 7．5，鹽度31．0 ‰，溶解氧6．75 mg/L，無(wú)色透明;細(xì)菌總數(shù) ＜10 CFU/ml，糞大腸菌群＜20 MPN/L。

1．4 檢測(cè)方法

1．4．1 貝類大腸桿菌和菌落總數(shù)的檢測(cè)。大腸桿菌按照GB4789．38-2012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)。將貝類撬殼稱取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，制作成1∶10的樣品勻液。選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液)，每個(gè)稀釋度接種3管，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵和生理生化試驗(yàn)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性管數(shù)，查MPN表。

菌落總數(shù)按照GB4789．2-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定。將貝類撬殼稱取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，制作成1∶10的樣品勻液。然后，選擇合適的3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做二個(gè)平板，用滅菌冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，(30±1)℃培養(yǎng)(72±3)h。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

1．4．2 海水中糞大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)。參照GB17378．7-2007海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)。糞大腸菌群采用發(fā)酵法測(cè)定，細(xì)菌總數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

1．5 凈化試驗(yàn)方法［6］以縊蟶為研究貝類，采集樂(lè)清灣受污染較為嚴(yán)重的縊蟶，當(dāng)天立即對(duì)縊蟶中大腸桿菌和菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)縊蟶樣品進(jìn)行暫養(yǎng)和凈化，暫養(yǎng)海水持續(xù)充氧，每隔24 h換水1次。此后每天換水前抽樣檢測(cè)縊蟶樣品中大腸桿菌和菌落總數(shù)，連續(xù)抽樣檢測(cè)5 d。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同品種貝類對(duì)微生物富集能力研究 對(duì)樂(lè)清灣15個(gè)監(jiān)測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行了3個(gè)批次的采樣檢測(cè)，樣品總數(shù)為45個(gè)。其中，縊蟶25個(gè)、文蛤10個(gè)、泥蚶10個(gè)。由表1可知，縊蟶中大腸桿菌的含量范圍為4 600～110 000 MPN/kg，菌落總數(shù)的含量范圍為1．2×104～3．9 ×105CFU/g，在抽檢的3個(gè)貝類品種中其數(shù)值范圍和上限最高。依據(jù)《農(nóng)業(yè)關(guān)于印發(fā)2015年度海水貝類產(chǎn)品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)和生產(chǎn)區(qū)域劃型工作方案的通知》(農(nóng)漁發(fā)［2015］16號(hào))文件，大腸桿菌數(shù)值為110 000 MPN/kg的貝類屬于第三類生產(chǎn)區(qū)(大于46 000 MPN/kg，且小于等于460 000 MPN/kg)，該區(qū)域生產(chǎn)的貝類產(chǎn)品須進(jìn)行暫養(yǎng)或凈化，需達(dá)到二類生產(chǎn)區(qū)域(大于2 300 MPN/kg，且小于等于46 000 MPN/kg)貝類安全標(biāo)準(zhǔn)后方可上市。文蛤與泥蚶的大腸桿菌和菌落總數(shù)的含量范圍相近，二者沒(méi)有顯著差異。這2種貝類的大腸桿菌數(shù)值符合二類生產(chǎn)區(qū)域的要求，可上市但不可生食。

表1 不同品種貝類的微生物含量

2．2 貝類生長(zhǎng)水體的微生物測(cè)定 為了研究貝類生長(zhǎng)環(huán)境水質(zhì)對(duì)其富集微生物的影響，分別選取溫嶺、玉環(huán)和樂(lè)清各1個(gè)貝類養(yǎng)殖位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)的海水中糞大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并抽取5個(gè)相應(yīng)位點(diǎn)的貝類樣品進(jìn)行大腸桿菌和菌落總數(shù)檢測(cè)。由表2可知，海水中的糞大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)含量越高，則該環(huán)境下生長(zhǎng)的貝類中大腸桿菌和菌落總數(shù)就越高。因此，二者呈一定的正相關(guān)。海水是貝類生長(zhǎng)的直接外界環(huán)境，海水中的微生物會(huì)直接影響貝類的細(xì)菌含量。

表2 貝類生長(zhǎng)水體的微生物含量

表3 凈化試驗(yàn)中大腸桿菌和菌落總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

2．3 凈化試驗(yàn) 以縊蟶為研究貝類，樣品采集當(dāng)天縊蟶中大腸桿菌的檢出值＞110 000 MPN/kg，菌落總數(shù)為3．1×105CFU/g，該貝類生產(chǎn)區(qū)屬于第三類生產(chǎn)區(qū)，該區(qū)域生產(chǎn)的貝類須進(jìn)行暫養(yǎng)或凈化。凈化試驗(yàn)每隔24 h換水1次，每天換水前進(jìn)行抽樣檢測(cè)，連續(xù)抽樣5 d。由表3可知，凈化第1天縊蟶中大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果為46 000 MPN/kg，已符合二類生產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)，可上市但不可生食。隨著暫養(yǎng)凈化時(shí)間的增加，縊蟶中大腸桿菌的數(shù)值也隨之減少，第3天大腸桿菌的檢測(cè)數(shù)值為2 300 MPN/kg，符合一類生產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)，該區(qū)域生產(chǎn)的貝類產(chǎn)品可直接上市。第4、5天大腸桿菌的檢測(cè)數(shù)值小于300 MPN/kg，表明大腸桿菌已經(jīng)很難被檢出。同時(shí)，菌落總數(shù)的檢出值也隨著暫養(yǎng)凈化時(shí)間的增加而減少，第5天菌落總數(shù)的檢出值為1．8×102CFU/g。

3 小結(jié)

筆者研究了不同品種貝類對(duì)微生物富集能力的差異，貝類生長(zhǎng)環(huán)境水質(zhì)對(duì)其富集微生物的影響和微生物污染貝類的海水凈化試驗(yàn)。結(jié)果表明，在研究的縊蟶、文蛤、泥蚶樣品中縊蟶富集大腸桿菌和菌落總數(shù)的數(shù)值相對(duì)較高，文蛤和泥蚶富集能力沒(méi)有顯著性差異;海水中的糞大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)含量越高，則該環(huán)境下生長(zhǎng)的貝類中大腸桿菌和菌落總數(shù)就越高，二者呈一定的正相關(guān);污染的縊蟶隨著暫養(yǎng)凈化時(shí)間的增加，縊蟶中大腸桿菌和菌落總數(shù)的數(shù)值也隨之減少。

［1］林志華，尤仲杰．浙江灘涂貝類養(yǎng)殖高產(chǎn)技術(shù)模式［J］．海洋科學(xué)，2005，29(8):95-99．

［2］朱秋華，錢國(guó)英．浙江省貝類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展策略初探［J］．浙江萬(wàn)里學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，13(2):16-17．

［3］柴雪良，張炯明，方軍，等．樂(lè)清灣、三門灣主要濾食性養(yǎng)殖貝類碳收支的研究［J］．上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15(1):52-58．

［4］宋凱，郭遠(yuǎn)明，梅光明，等．浙南主要養(yǎng)殖海域環(huán)境和貝類兩種重金屬含量調(diào)查研究［J］．水產(chǎn)科技情報(bào)，2014，41(3):120-123．

［5］陳雪昌，梅光明，郭遠(yuǎn)明，等．浙江沿岸養(yǎng)殖貝類有毒有害物質(zhì)污染狀況監(jiān)測(cè)研究［J］．浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，30(1):40-45．

［6］鮑靜姣，郭遠(yuǎn)明，金雷，等．受污染縊蟶大腸埃希氏菌的凈化研究［J］．廣州化工，2014，42(16):65-66．