李步榮,尋 萌,段 釗,袁景奕,張 彤,李麗華

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院檢驗科710004；2.西安交通大學醫(yī)學院病原生物學系 710061；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科710004；4.西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚性病科 710004)

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·論 著·

應用PCR-RDB雜交技術檢測人類乳頭瘤病毒基因型的臨床意義

李步榮1,尋 萌2,段 釗3,袁景奕4,張 彤1,李麗華1

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院檢驗科710004；2.西安交通大學醫(yī)學院病原生物學系 710061；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科710004；4.西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚性病科 710004)

目的 采用聚合酶鏈反應(PCR)和反向斑點雜交(RDB)技術檢測西安地區(qū)人類乳頭瘤病毒(HPV)感染流行狀態(tài)和HPV基因型分布特征。方法 共收集266例脫落細胞標本，其中尖銳濕疣86例、宮頸上皮內(nèi)瘤變144例、宮頸癌36例，應用PCR-RDB雜交技術進行23種HPV基因型分型檢測。結(jié)果 全部標本HPV總陽性率為71.43%(190/266)，宮頸癌HPV陽性率明顯高于其他疾病，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.297,P<0.05)；HPV陽性標本基因分型全部成功，HPV16型為主要感染基因型，其次為HPV18、6、11型；單基因型總感染率91.58%(174/190)，多基因型總感染率8.42%(16/190)。不同疾病單基因型感染和多基因型感染構(gòu)成比差異無統(tǒng)計意義(χ2=0.3511,P>0.05)。結(jié)論 HPV16型是西安地區(qū)主要感染基因型，應用PCR-RBD技術檢測HPV基因型對HPV感染的防治具有一定臨床意義。

人類乳頭瘤病毒； 基因分型； 聚合酶鏈反應； 反向斑點雜交技術

人類乳頭瘤病毒(HPV)感染主要引起人皮膚和黏膜上皮細胞增生性病變，常見有尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌等疾病。依據(jù) HPV 致病性不同將其分為高危型(HR)和低危型(LR)兩種。LR-HPV為尖銳濕疣主要致病因子，以HPV6型為主，其次是HPV11型。HR-HPV 是宮頸癌的主要發(fā)病因素，其中HPV16、18型是最為常見的基因型[1-2]。HPV 基因型流行分布有地區(qū)差異性，不同基因型具有不同的病毒生物學特性，易感人群也不盡相同[3-4]。因此，有必要對HPV感染患者進行基因分型，及時掌握西安地區(qū)HPV感染基因型分布特征，對HPV的防治和疫苗研發(fā)具有重要意義。聚合酶鏈反應(PCR)和反向斑點雜交 (RDB)技術在病毒基因型檢測中具有特異、敏感和高通量等優(yōu)點，本研究選用深圳亞能公司生產(chǎn)的可檢測HPV23種基因型反向雜交試劑盒進行HPV基因型檢測，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2014年1～12月于西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚性病門診及婦科門診患者送檢的脫落細胞標本266例，其中男51例,年齡17～76歲，平均(38.94±14.30)歲；女215例，年齡19～78歲，平均(44.71±14.72)歲。經(jīng)病理學確診，尖銳濕疣86例，宮頸上皮內(nèi)瘤變144例，宮頸癌36例。

1.2 儀器與試劑 采用TC-412型TECHNE通用PCR儀(英國Bibby Scientific Limited公司)，YN-H16型分子雜交儀(深圳亞能生物技術有限公司生產(chǎn))，TGL-16g高速低溫離心機 (上海安亭科學儀器廠)；HPV基因分型檢測試劑盒購自亞能生物技術有限公司，包括18種HR-HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4等)和5種LR-HPV基因型(6、11、42、43、44)。

1.3 取材方法 充分暴露病變部位，常規(guī)清潔消毒，用無菌棉拭子反復用力擦拭病變部位表面獲取脫落細胞，將取樣后的棉拭子放入裝有1 mL生理鹽水的無菌管中，做好標記立即送檢。

1.4 PCR-RDB雜交技術

1.4.1 HPV-DNA提取 充分洗脫棉拭子上黏附的脫落細胞。加1 mL洗脫液于離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入50 μL裂解液充分裂解懸浮沉淀，100 ℃恒溫10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清液待用。

1.4.2 PCR擴增 取上清液5 μL加入裝有PCR反應體系的反應管中，放入擴增儀，按以下參數(shù)進行擴增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；(94 ℃ 30 s，42 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s)×40 Cycles；最后72 ℃ 5 min。

1.4.3 分子雜交 取15 mL塑料離心管，加入標記膜條，加入A液(0.3 mol/L NaCl、0.03 mol/L枸櫞酸鈉及0.003 μmol/L SDS) 5～6 mL及PCR擴增產(chǎn)物25 μL，100 ℃恒溫水浴10 min，51 ℃雜交至少1.5 h。

1.4.4 洗膜 取出膜條，移至裝有預熱B液(0.075 mol/L NaCl、 0.008 mol/L枸櫞酸鈉及0.003 μmol/L SDS)的50 mL管中，于51 ℃輕搖洗滌5 min。

1.4.5 孵育 取出膜條，置于孵育液中，室溫輕搖孵育30 min，棄去孵育液，換A液重復2次，每次5 min。用0.1 mol/L枸櫞酸鈉洗膜1～2 min。

1.4.6 顯色和結(jié)果判讀 新鮮配制顯色液。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色30 min后，轉(zhuǎn)移至去離子水，按試劑說明書觀察判斷結(jié)果，必要時可借助儀器進行結(jié)果閱讀。

2 結(jié) 果

2.1 不同疾病中HPV檢測結(jié)果 見表1。全部266例標本中190例HPV陽性，陽性率71.43%。尖銳濕疣HPV陽性率69.77(60/86)，宮頸上皮內(nèi)瘤變陽性率68.06%(98/144)，宮頸HPV陽性率88.89%(32/36)，宮頸癌HPV感染陽性率明顯高于其他疾??；不同疾病組HPV感染率差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=6.297，P<0.05)。

表1 不同疾病中HPV檢測結(jié)果[n(%)]

2.2 HPV基因型分布 見表2。本研究中190例HPV陽性標本均分型成功，有兩種和兩種以上基因型陽性者為多基因型感染，對多基因型感染者基因型陽性率進行重復計算。HPV16型為主要流行基因型，其中單基因型感染53例，多基因型感染13例。其他基因型依次為HPV18、6、11型。HPV51、59、73、83、MM4型在本研究中無論是單基因型感染還是多基因型感染都未檢出。

表2 HPV基因型分布

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.3 不同疾病中HPV單基因型和多重基因型感染結(jié)果 見表3。在尖銳濕疣中，單基因型感染56例(93.33%)，多基因型感染4例(6.67%)；在宮頸上皮內(nèi)瘤變中，單基因型感染為89例(90.82%)，多基因型感染9例(9.18%)；在宮頸癌中，單基因型感染29例(90.63%)，多基因型感染3例(9.37%)。單基因型總感染率91.58%，多基因型總感染率8.42%。不同疾病單基因型和多重基因型感染情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.3511,P>0.05)。

表3 不同疾病中HPV單基因型和多重基因型感染結(jié)果[n(%)]

3 討 論

HPV是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA無包膜病毒，約8 Kb，HPV基因組按功能可分為早期區(qū) (E區(qū))、晚期區(qū) (L區(qū))和非編碼區(qū) (NCR)3個區(qū)域。E區(qū)分為 E1～E7開放閱讀框架，主要編碼與病毒復制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和細胞轉(zhuǎn)化有關的蛋白。L區(qū)分L1和L2，分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。L1基因既保守又具有型特異性，是HPV基因分型目標區(qū)域。判定1個HPV新基因型需具備基因組全序列，且E6、L1、上游調(diào)控區(qū) (URR)基因與已知HPV相應基因同源性要小于90%。迄今發(fā)現(xiàn)的HPV型別已經(jīng)超過100多種，隨著研究的深入，新的基因型不斷被鑒定發(fā)現(xiàn)[5]。不同基因型與所致疾病特點之間的關系逐步成為目前研究的熱點和難點。

HPV不能在體外培養(yǎng)，不能通過血清學方法進行分型。PCR-RDB分子雜交技術是一種微量DNA分析技術，對實驗室和儀器設備要求相對不高，可以在分子診斷實驗室廣泛開展。本研究所用試劑原理是在尼龍膜上固定了 23種HPV型特異性探針及一個β球蛋白作為對照探針，和PCR擴增的DNA片段按堿基配對原則進行核酸雜交，即可快速、準確區(qū)分HPV基因型。此方法不僅實現(xiàn)了HPV感染的快速檢測，同時又可以進行HPV基因分型，還可以確定是單基因型感染還是多重基因型感染，極大簡化了基因診斷的試驗流程[6]。對于試驗未能區(qū)分HPV基因型的標本，應進行病毒基因測序，通過核酸序列比對最終確定其基因型。本研究全部標本都能成功分型，說明本試劑盒檢測范圍基本包含了西安地區(qū)流行的HPV基因型，滿足了當前試驗要求。

HPV 基因型的分布存在人種和地域差異，不同基因型感染其致病性不同。本研究對象包含了由HPV感染所引起的幾種常見疾病，通過檢測其基因型，基本能夠反映西安地區(qū)HPV基因型的流行趨勢和分布狀況。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌HPV陽性率明顯高于尖銳濕疣和宮頸上皮內(nèi)瘤變，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.297，P<0.05)。單基因型總感染率91.58%，多基因型感染率8.42%，單基因型感染是主要感染類型。在不同疾病間單基因型感染和多基因型感染構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=0.351 1,P>0.05)，本研究結(jié)果與國內(nèi)外其他地區(qū)比較有一定差異[7-12]。本研究并未對宮頸上皮內(nèi)瘤變患者進行疾病分級比較，主要是因為標本量少，分層后研究結(jié)果不能全面反映實際情況。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是高危型還是低危型HPV，在各種疾病中都有檢出，多基因型感染既可以是低危型或者高危型之間的復合感染，也可以是低危型和高危型之間復合感染。HPV16型為本研究最常見基因型，其次為HPV18型，這有可能與所選研究對象中宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者較多有關。在尖銳濕疣中，HPV6型和HPV11型是主要感染基因型，不同疾病HPV主要流行基因型存在一定差異。

目前，HPV感染致病機制尚不完全明確，各種治療手段不能完全控制和消滅HPV的感染和流行。我國地域遼闊、人口基數(shù)大，隨著經(jīng)濟飛速發(fā)展，人員流動增加，HPV感染基因型分布是一個動態(tài)變化狀態(tài)。不同地區(qū)感染HPV基因型分布資料還不夠全面，仍需通過進行HPV基因型檢測進一步完善其流行病學資料，為人類最終消滅HPV感染提供科學的實驗室依據(jù)。

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Clinical significance of genotyping detection of human papillomavirus by using PCR-RDB

LIBu-rong1,XUNMeng2,DUANZhao3,YUANJing-yi4,ZHANGTong1,LILi-hua1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China;2.DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofMedicine,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710061,China;3.DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China;4.DepartmentofDermatologyandVenerealDisease,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China)

Objective To study the HPV infection situation and its genotype distribution characteristics in Xi′an by using polymerase chain reaction (PCR) and reverse dot blot (RDB) technology.Methods 266 samples of exfoliative cells were collected,including 86 cases of condyloma acuminatum,144 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 36 cases of cervical cancer.23 kinds of HPV genotyping detection were performed by using PCR-RDB.Results The total positive rate of HPV in all of the samples was 71.43%(190/266).The HPV positive cases in cervical cancer was significantly higher than that in the other diseases (χ2=6.297,P<0.05).Genotyping in the HPV positive samples was successfully conducted.HPV16 was the most predominant genotype,the next genotypes were HPV18,6 and 11.The overall infection rate of single HPV genotype was 91.58%(174/190),which of multiple HPV genotypes was 8.42%(16/190).There was no statistically significant difference of the constituent ratio between single genotype infection and multiple genotype infection in different diseases (χ2=0.351 1,P>0.05).Conclusion HPV16 is the main infection genotype in Xi′an area.Detection of HPV genotypes by using PCR- RDB technology has certain significance to the prevention and treatment of HPV infection.

human papillomavirus; genotyping; PCR； reverse dot blot

李步榮,男,博士,副主任檢驗師,主要從事病毒分子生物學診斷工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.028

A

1672-9455(2015)24-3684-03

2015-04-22

2015-07-25)