李啟欣，朱嫦琳，陳文翠，李煒煊

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 528000)

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·論 著·

NS1抗原捕獲ELISA在登革熱篩查及診斷中的應(yīng)用

李啟欣，朱嫦琳，陳文翠，李煒煊△

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 528000)

目的 評(píng)價(jià)檢測(cè)登革病毒NS1抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(NS1-ELISA)在登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2014年9～10月在廣東省佛山市第一人民醫(yī)院就診的疑似登革熱病毒感染的患者共173例，分別采用NS1-ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和膠體金免疫層析法(以下簡(jiǎn)稱金標(biāo)法)對(duì)其血清中的登革病毒標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，比較3種方法對(duì)登革熱診斷的靈敏度、特異性、預(yù)測(cè)值、似然比、約登指數(shù)和卡帕值。結(jié)果 173例疑似患者中共88例(50.87%)被確診為登革熱患者，檢測(cè)結(jié)果陽性率最高為金標(biāo)法，顯著高于NS1-ELISA和PCR；NS1-ELISA敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)均高于PCR和金標(biāo)法，陰性似然比低于PCR和金標(biāo)法，3種方法的敏感度差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PCR和NS1-ELISA特異性顯著優(yōu)于金標(biāo)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PCR特異性高于NS1-ELISA，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 NS1-ELISA對(duì)登革熱的檢測(cè)效能和應(yīng)用價(jià)值優(yōu)于PCR和金標(biāo)法，可作為登革熱暴發(fā)或散發(fā)的篩查及確診方法。

登革熱； 登革病毒； NS1抗原； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

登革熱是一種全球性的急性蟲媒傳染病，由登革病毒引起，經(jīng)伊蚊傳播，多流行于熱帶和亞熱帶，尤其是東南亞國家，是我國重點(diǎn)監(jiān)測(cè)與控制的傳染病之一[1]。廣東省是登革熱高流行區(qū)，2005～2012年全國報(bào)道發(fā)病人數(shù)中，廣東省病例占全國的71.65%，暴發(fā)病例所占比例更高達(dá)85.68%[2]。2014年夏、秋季，廣東地區(qū)再次暴發(fā)登革熱，至2014年10月止，全省確診病例超過4萬例，因此，及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)和預(yù)防十分重要。目前基層醫(yī)院常用的檢測(cè)方法為膠體金免疫層析法，初篩陽性后再送當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確診，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不利于早期發(fā)現(xiàn)，且檢測(cè)要求較高。針對(duì)登革病毒 NS1抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有耗時(shí)較短且敏感性和特異性較好的特點(diǎn)，本研究對(duì)此3種方法進(jìn)行比較，為尋找快速準(zhǔn)確診斷登革熱的方法提供重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來自2014年9～10月于本院就診的疑似登革熱病毒感染患者共173例，其中男90例，女83例，年齡1～83歲，平均(35.13±20.18)歲。采用普通干燥管采集靜脈血4 mL，3 000 g離心15 min后分離血清待測(cè)。

1.2 檢測(cè)原理

1.2.1 針對(duì)登革病毒 NS1抗原的ELISA(以下簡(jiǎn)稱NS1-ELISA) 登革病毒NS1抗原檢測(cè)試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，采用雙抗體夾心ELISA原理，檢測(cè)樣品中登革病毒NS1抗原。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(以下簡(jiǎn)稱PCR) 登革熱病毒通用型核酸檢測(cè)試劑、登革熱DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型病毒核酸熒光檢測(cè)試劑盒均購自上海之江生物科技有限公司，核酸提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。

1.2.3 膠體金免疫層析法(以下簡(jiǎn)稱金標(biāo)法) 登革熱快速診斷試劑盒購自澳大利亞PanBio公司。

1.3 檢測(cè)方法 全部送檢血清標(biāo)本同時(shí)采用3種方法進(jìn)行檢測(cè)，所有方法均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 確診標(biāo)準(zhǔn) 按衛(wèi)生部發(fā)布的登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS216-2008)[3]進(jìn)行確診。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件，采用四格表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，計(jì)算3種方法對(duì)登革熱診斷的敏感度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性似然比、陰性似然比、約登指數(shù)(YI)及Kappa(κ)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 根據(jù)患者的登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS216-2008)送檢的173例疑似患者中，88例(50.87%)被確診為登革熱，85例(49.13%)為其他病因引起的發(fā)熱。

2.2 3種方法檢測(cè)登革熱檢出率分析 見表1。173例登革熱疑似患者中，檢測(cè)結(jié)果陽性率(72.25%，125/173)最高為金標(biāo)法，高于NS1-ELISA的(58.96%，102/173)和PCR的(54.34%，94/173)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.776，P=0.009；χ2=11.955，P=0.001)，NS1-ELISA又高于PCR，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.753，P=0.385)。

2.3 3種方法對(duì)登革熱的檢測(cè)效能分析 3種方法對(duì)登革熱疑似患者血清檢測(cè)的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性似然比、陰性似然比、YI和κ值見表2。由表2可見，NS1-ELISA敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和YI均高于PCR和金標(biāo)法，陰性似然比低于PCR和金標(biāo)法，κ值與PCR相等，特異性和陽性似然比明顯高于金標(biāo)法，稍低于PCR，由此表明NS1-ELISA對(duì)登革熱診斷價(jià)值較高。

表1 3種方法檢測(cè)登革熱檢出率分析

表2 3種方法對(duì)登革熱檢測(cè)效能

2.4 3種方法敏感度和特異性比較 見表3。對(duì)3種方法的敏感度和特異性進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PCR和NS1-ELISA特異性顯著優(yōu)于金標(biāo)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PCR特異性高于NS1-ELISA，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.408)。

表3 3種方法敏感度和特異性比較

3 討 論

登革熱是世界上尤其是熱帶地區(qū)最重要的蟲媒傳播疾病之一。登革熱檢測(cè)有登革熱病毒分離、抗體血清學(xué)檢測(cè)及針對(duì)病毒核酸分子生物學(xué)檢測(cè)等多種方法。病毒分離法準(zhǔn)確可靠，是登革病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣，敏感度低，不宜用于早期診斷[4]。血清學(xué)檢測(cè)方法主要有血凝抑制試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)、IgM//IgG捕獲ELISA及快速免疫層析法等，都是針對(duì)登革病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)，各種方法都存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)[5-6]。分子生物學(xué)方法主要包括反轉(zhuǎn)錄-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法等，敏感性更高，可用于早期診斷，但檢測(cè)要求較高，不適合于基層醫(yī)院開展[7]。

NS1-ELISA檢測(cè)的是登革病毒的NS1抗原，NS1是登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，僅存在于4種型別的登革病毒而不存在于其他黃病毒屬病毒，因此無交叉反應(yīng)，特異性好。NS1在發(fā)病早期即出現(xiàn)，檢測(cè)窗口寬，可達(dá)到早期檢測(cè)和隨時(shí)檢測(cè)的目的，靈敏度和特異性較高，應(yīng)用前景良好[8]。本研究選用的金標(biāo)法采用未稀釋的血清檢測(cè)，根據(jù)測(cè)試卡上的條帶直接判斷抗體類型(如IgM、IgG) 和感染情況(如初次感染、二次感染)[9]。金標(biāo)法簡(jiǎn)單實(shí)用、結(jié)果直觀，可用于疾病流行期間的疾病初篩，增加檢出率，但由于特異性較差，在散發(fā)情況下可能會(huì)產(chǎn)生較多的假陽性。PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，將熒光技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)結(jié)合，對(duì)病毒核酸進(jìn)行精確定量，敏感度和特異性好，但一般僅在地區(qū)疾病控制中心及少部分大型綜合醫(yī)院開展，不用于常規(guī)篩查。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)送檢的登革熱疑似患者，金標(biāo)法陽性率顯著高于NS1-ELISA和PCR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3種方法檢測(cè)的陽性率均高于文獻(xiàn)[10-11]的報(bào)道，與本年度登革熱暴發(fā)流行及試劑廠家不同有關(guān)。高流行率導(dǎo)致確診患者在疑似患者中的比例上升，因此檢出率隨之上升。不同廠家生產(chǎn)的試劑采用的檢測(cè)抗體和標(biāo)記方法不完全相同，敏感度和特異性也存在一定差異。從檢測(cè)效能分析結(jié)果可見，3種方法的敏感度未發(fā)現(xiàn)差異，NS1-ELISA和PCR的特異性相當(dāng)(81.18%vs. 85.88%)，均顯著高于金標(biāo)法(50.59%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，略低于文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的數(shù)據(jù)。由此提示金標(biāo)法敏感度好但特異性較差，僅適合于初篩而不能用于確診。NS1-ELISA和PCR特異性較好，可用于登革熱的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷。YI又稱為正確指數(shù)，是綜合評(píng)價(jià)篩查試驗(yàn)真實(shí)性的方法，YI越大說明篩查試驗(yàn)效果越好，真實(shí)性越大。本研究結(jié)果表明，NS1-ELISA 和PCR的YI均達(dá)到0.8左右，由此提示兩種方法對(duì)登革熱有較好的篩查價(jià)值。對(duì)3種方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，PCR和NS1-ELISA的陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均在90%左右，由此表明這兩種方法檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際符合程度較高。由于在選擇診斷試驗(yàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇陽性似然比大而陰性似然比小的試驗(yàn)，因此，PCR和ELISA都可作為登革熱的診斷手段。

考慮到PCR檢測(cè)要求較高，需要特定的檢測(cè)環(huán)境和技術(shù)人員，且易出現(xiàn)假陽性，因此目前尚未在臨床上廣泛使用。本研究證明，NS1-ELISA與PCR檢測(cè)效能相當(dāng)，敏感度、YI甚至高于PCR，且NS1-ELISA檢測(cè)的是病毒抗原，不同于傳統(tǒng)ELISA，無需等到患者恢復(fù)期出現(xiàn)抗體，在整個(gè)發(fā)病期均可檢測(cè)到，可用于登革熱的早期診斷[4]。此外，由于ELISA對(duì)設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)低廉，易實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)，因此可作為登革熱暴發(fā)或散發(fā)的篩查及確診方法。目前常用的實(shí)驗(yàn)室手段為金標(biāo)法篩查陽性后送當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心進(jìn)行PCR確診，NS1-ELISA可簡(jiǎn)化流程，節(jié)省人力物力，大大縮短實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)間，可作為登革熱篩查和早期診斷的首選方法，可于臨床推廣應(yīng)用。

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Application of NS1 antigen capture ELISA in screening and diagnosis of dengue fever

LIQi-xin,ZHUChang-lin，CHENWen-cui，LIWei-xuan△

(DepartmentofMedicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofFoshan,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To assess the application value of NS1 antigen capture ELISA (NS1-ELISA) in the laboratorial diagnosis of dengue fever.Methods Serum samples were obtained from 173 borderline cases of dengue virus infection in the First People′s Hospital of Foshan from September to October in 2014.Serum markers of dengue virus were detected by NS1-ELISA,PCR and immunogold labeling assay (IGLA),respectively.The sensitivity,specificity,predictive value (PV),likelihood ratio (LR),Youden′s index (YI) and kappa value of 3 methods in diagnosis of dengue fever were assessed.Results Among 173 patients,there were 88 cases (50.87%) diagnosed to be dengue fever.IGLA had the highest positive rate,which was significantly higher than NS1-ELISA and PCR.The sensitivity,PV,and YI of NS1-ELISA were higher than IGLA and PCR,while LR was lower.No significant differences were found in sensitivities among 3 methods (P>0.05).The specificities of NS1-ELISA and PCR were both higher than IGLA (P<0.05),but no significant differences of the specificities were found between NS1-ELISA and PCR (P>0.05).Conclusion NS1-ELISA had better detection efficiency and application value than PCR and IGLA,which could be the ideal method for screening and diagnosis of dengue fever when it outbroke or sporadically occured.

dengue fever; dengue virus; NS1 antigen； ELISA

李啟欣，男，本科，主任技師，主要從事生化免疫檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室管理?！?/p>

,E-mail:lwx21cn@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.024

A

1672-9455(2015)24-3673-03

2015-06-04

2015-08-10)