武紅梅，鄧麗萍，胡園園，龍愛梅，黃 瑩，黃 震，沈明靜

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116)

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·論 著·

維格列汀對糖尿病腎病保護(hù)作用機(jī)制探討*

武紅梅，鄧麗萍，胡園園，龍愛梅，黃 瑩，黃 震，沈明靜△

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116)

目的 研究結(jié)締組織生長因子(CTGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在大鼠糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展中的作用，探討維格列汀對糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制。方法 將60只大鼠分為A、B、C 3組， A、B兩組給予鏈脲佐菌素用于制備大鼠糖尿病腎病模型組,然后分別給予維格列汀8 mg/(kg·d)灌胃連續(xù)治療8周和12周，C組為對照組，只給予生理鹽水灌胃。處死大鼠，檢測A、B兩組大鼠血糖、24 h尿蛋白定量和血清CTGF和VEGF表達(dá)水平。進(jìn)一步測定腎重指數(shù),形態(tài)學(xué)觀察腎小球體積及腎小球基底膜變化，測定腎小球平均截面積(MGA),計(jì)算腎小球平均體積(MGV)，比較其MGA和MGV。結(jié)果 大鼠糖尿病組血糖、24 h尿蛋白定量和CTGF、VEGF水平明顯高于對照組。經(jīng)維格列汀治療后大鼠糖尿病腎病組血糖、24 h尿蛋白定量和CTGF、VEGF水平顯著下降，治療12周后以上各項(xiàng)指標(biāo)比治療8周下降更明顯，腎重指數(shù)降低，腎臟肥大程度減輕，且治療前、后CTGF和VEGF水平呈正相關(guān)。結(jié)論 CTGF和VEGF可作為糖尿病腎病患者病情評估有價值的指標(biāo)，維格列汀可能部分通過調(diào)控CTGF和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

糖尿病腎?。?結(jié)締組織生長因子； 血管內(nèi)皮生長因子； 維格列汀

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，其病理變化表現(xiàn)為腎小球、腎小管肥大，腎小球腎小管基底膜增厚，腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)堆積及腎小球硬化[1]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，有研究表明，VEGF 參與蛋白尿的產(chǎn)生和腎臟肥大形成，與DN 關(guān)系密切[2]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)在腎臟表達(dá)尤為豐富，它介導(dǎo)了轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚的效應(yīng)，參與組織纖維化過程，促進(jìn)腎臟腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)聚集、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[3]。給予二肽基肽酶-4抑制劑(DPP-4)維格列汀通過調(diào)控CTGF和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮糖尿病腎臟保護(hù)作用，其國內(nèi)外報道甚少。因此，本研究給予DN大鼠維格列汀治療，通過檢測主要反映DN病情進(jìn)展的指標(biāo)(血糖和24 h尿蛋白)及檢測反映腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的2個項(xiàng)目(CTGF、VEGF)血清學(xué)表達(dá)水平，旨在探討維格列汀對DN大鼠腎臟的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；鏈脲佐菌素(STZ)，美國sigma公司；DPP-4維格列汀，諾華制藥有限公司產(chǎn)品；尿蛋白試劑盒購自南京建成科技有限公司； CTGF、VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 大鼠分為A、B、C 3組， A、B兩組單次腹腔注射65 mg/kg STZ，STZ用0.1 mmo1/L無菌枸櫞酸緩沖液配制(pH=4.5)。72 h后摘除眼球取血測定血糖，血糖大于或等于16.67 mmol/L的大鼠入組為糖尿病大鼠。連續(xù)4周測定血糖、24 h 尿蛋白，連續(xù)3 d隨機(jī)血糖大于或等于16.67 mmol/L ，24 h 尿蛋白大于30 mg/(kg·d)者為DN組。 然后分別給予維格列汀8 mg/(kg·d)灌胃連續(xù)治療8周和12周。C組為對照組，只給予生理鹽水灌胃。

1.3 儀器與試劑 血糖及24 h尿蛋白采用速率法,羅氏AU600全自動生化分析儀及配套試劑測定；血清CTGF和VEGF檢測采用ELISA，試劑由深圳晶美公司提供。奧地利AUTH2010全自動酶標(biāo)儀比色分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),操作嚴(yán)格按照儀器及試劑使用說明書執(zhí)行。

1.4 腎重指數(shù)檢測 各組大鼠喂養(yǎng)12周時稱體質(zhì)量，處死大鼠取雙腎并去掉腎包膜，冰鹽水沖洗后濾紙吸干，測雙腎重量。根據(jù)公式：腎重/體質(zhì)量=[雙側(cè)腎臟重量之和(g) /體質(zhì)量(g)] ×1 000進(jìn)行計(jì)算。

1.5 腎臟組織HE染色及腎組織病理圖像分析 取新鮮腎臟組織用生理鹽水沖洗干凈，然后采用甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，行HE染色。采用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)對病理染色切片(×400倍)進(jìn)行圖像分析。每個切片隨機(jī)選擇8個正切的腎小球，測定腎小球平均截面積(MGA)，取其平均值作為每個標(biāo)本的MGA，并根據(jù)公式：腎小球平均體積(MGV)=1.25×3/2(MGA)計(jì)算MGV。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白及CTGF與VEGF水平變化 見表1。與DN組和對照組相比，維格列汀組血糖、24 h尿蛋白、CTGF和VEGF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白及CTGF與VEGF水平變化

2.2 DN大鼠治療前、后血液CTGF與VEGF水平比較 見表2。由表2可見，DN大鼠治療12周后血清CTGF與VEGF水平顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 DN大鼠治療前、后血清CTGF與VEGF水平比較

2.3 各組大鼠模型腎重指數(shù)變化 DN組、維格列汀組、對照組腎重指數(shù)分別是(11.02±0.89)、(9.85±0.45)、(6.40±0.39)，維格列汀組腎臟肥大程度減輕，3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 病理切片圖像分析 見表3。DN 組 MGA、MGV明顯擴(kuò)大，維格列汀各治療組均有不同程度縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對照組、DN 組 MGA、MGV未見明顯擴(kuò)大。

表3 各組大鼠MGA MGV的變化

3 討 論

DN是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一，早期病理特征是腎小球肥大,腎小球及腎小管基底膜增厚，系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚，后期表現(xiàn)為腎小球、腎小管間質(zhì)纖維化,最終致蛋白尿和腎衰竭。DN發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前尚不完全清楚,可能與遺傳因素、高血糖、高血壓、血脂異常等代謝紊亂及某些免疫因子調(diào)控相關(guān)。本研究給予DPP-4抑制劑維格列汀通過調(diào)控CTGF和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮糖尿病腎臟保護(hù)作用，其國內(nèi)外報道較少。VEGF是1989年從培養(yǎng)的牛垂體濾泡星狀細(xì)胞分離出的一種相對分子質(zhì)量為(35～45)×103的二聚體糖蛋白[4]。近年強(qiáng)調(diào)微血管結(jié)構(gòu)在腎臟疾病進(jìn)展中的重要性，血管內(nèi)皮生長因子CTGF、 VEGF與DN的關(guān)系成為關(guān)注的熱點(diǎn)。 CTGF 是1991 年Bradham 等首先在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的，它是一種由349個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為(34～38)×103的富含半胱氨酸的分泌肽[5]。CTGF作為TGF-β1的下游因子，在腎臟表達(dá)尤為豐富，它介導(dǎo)了TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚的效應(yīng)，參與組織纖維化過程[6]。它的過度表達(dá)促進(jìn)腎臟腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)的聚集、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。

本研究通過測定DN大鼠血糖、24 h尿蛋白、腎重指數(shù)和MGA 、MGV變化，觀察腎小球的病理形態(tài)改變及大鼠血清學(xué)VEGF和CTGF的表達(dá)水平。隨著疾病進(jìn)程加重，本研究結(jié)果顯示,各組大鼠在早期就已出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病表現(xiàn)。隨著病情的進(jìn)展，血糖及24 h尿蛋白明顯高于同期對照組，出現(xiàn)腎臟病理損傷加重等DN表現(xiàn),由此表明研究過程中腎功能不斷受損，其病理變化表現(xiàn)為腎小球、腎小管肥大，腎小球、腎小管基膜增厚，腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)堆積及腎小球硬化。進(jìn)一步檢測反映腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化2項(xiàng)指標(biāo)CTGF和VEGF的血清學(xué)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，DN大鼠血清CTGF和VEGF水平顯著高于對照組，且經(jīng)過維格列汀治療后DN大鼠血糖及24 h尿蛋白及CTGF和VEGF水平顯著下降，且治療12周后以上各項(xiàng)指標(biāo)比治療8周下降更明顯，與文獻(xiàn)[7]報道一致。薛菲等[2]認(rèn)為，VEGF 與尿清蛋白排泄率呈正相關(guān)，表明高水平VEGF 會促進(jìn)蛋白尿產(chǎn)生，促進(jìn)腎臟組織損傷。本研究結(jié)果亦顯示，經(jīng)過維格列汀治療后CTGF和VEGF水平均顯著下降，且治療前、后CTGF和VEGF 2項(xiàng)指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，DN大鼠中CTGF和VEGF 2項(xiàng)因子明顯升高于同期對照組，因此推測CTGF和VEGF在大鼠DN發(fā)生和發(fā)展過程中起到加速作用，進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟病理損傷加重，最終發(fā)展為DN所起的作用可能是一對相輔相成的免疫因子。 CTGF是介導(dǎo)腎間質(zhì)炎性反應(yīng)最重要炎性反應(yīng)趨化因子之一，在多種腎臟疾病的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮作用，是關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一，參與DN 的病理過程，是導(dǎo)致糖尿病腎損害的重要原因[8]。本研究結(jié)果顯示，CTGF與DN大鼠彌漫性腎小球硬化與巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)，提示長期高血糖刺激，使CTGF促使血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，其結(jié)果導(dǎo)致白細(xì)胞黏附增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生慢性炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)DN形成。隨DN進(jìn)一步加重CTGF呈進(jìn)行性上升趨勢，導(dǎo)致腎小球高濾過、清蛋白排泄、腎小球肥大等，由此提示CTGF和VEGF參與了DN發(fā)病及發(fā)生和發(fā)展。

腸促胰素類藥物是目前用于治療2型糖尿病較新的一類藥物，腸促胰素類藥物有兩類:一類是胰高血糖素樣肽-1類似物，一類是DPP-4抑制劑[9]。臨床研究顯示，此類藥物不僅可有效控制血糖，還能減少體質(zhì)量增加、降低低血糖發(fā)生的風(fēng)險。與此同時，臨床試驗(yàn)及動物研究亦發(fā)現(xiàn)，腸促胰島素類藥物對DN具有保護(hù)作用，為DN的治療提供了新的思路[10]。維格列汀治療組與DN組相比，不僅能明顯降低血糖、尿蛋白，減輕腎臟體積，用藥后腎組織病理損傷也減輕。說明維格列汀具有一定的腎臟保護(hù)作用,減少尿蛋白及腎臟保護(hù)作用更強(qiáng)。本研究證實(shí),糖尿病患者血CTGF水平可作為診斷早期腎損害較敏感的指標(biāo)，其水平也與DN嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，有助于監(jiān)測、判斷其病程進(jìn)展情況[11]。提示CTGF與VEGF參與DN的發(fā)病過程，阻斷或減弱其表達(dá)將成為DN更有效的治療途徑。早期對VEGF進(jìn)行干預(yù)，如使用小分子VEGF受體抑制劑及抗黏附分子治療，可降低血管高滲透性，減輕蛋白尿及腎小球肥大，同時阻斷或減弱CTGF表達(dá)，將成為DN更有效的治療途徑。

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Investigation of protection mechanism of vildagliptin to diabetic nephropathy*

WUHong-mei,DENGLi-ping,HUYuan-yuan,LONGAi-mei,HUANGYing,HUANGZhen,SHENMing-jing△

(CentralHospitalofLonggangDistrict,Shenzhen,Guangdong518116,China)

Objective To study the role of CTGF and VEGF in the occurrence and development of rat diabetic nephropathy,and to investigate the protection mechanism of vildagliptin to diabetic nephropathy.Methods 60 rats were divided into three groups:group A,B and C.Group A and B were treated by streptozotocin for the preparation of diabetic nephropathy rat models.Then the diabetic nephropathy rats of group A and B were treated by continuous intragastric administration of 8 mg/(kg·d) vildagliptin for 8 and 12 weeks respectively.Group C was control group,and just given intragastric administration of saline.The rats were killed,then blood glucose,24 h urine protein,and the expression levels of CTGF and VEGF of rats in group A and B were detected.Furthermore,kidney weight index,morphological observation of glomerular volume,glomerular basement membrane changes were determinated as well as the glomerular average sectional area (MGA) and the average calculated glomerular volume (MGV) were compared.Results The levels of blood glucose,24 h urine protein,CTGF and VEGF of group A and B were significantly higher than those of control group.After vildagliptin treatment,the levels of blood glucose,24 h urine protein,CTGF and VEGF reduced in both of group A and B,and those in group B reduced more significantly than group A.At the same time,both of the kidney weight index and the degree of renal hypertrophy reduced after treatment,and the levels of CTGF and VEGF were positively correlated before and after treatment.Conclusion CTGF and VEGF could serve as a valuable indexes of diabetic nephropathy.Vildagliptin might play a role of renal protection via partially regulate the expression of CTGF and VEGF.

diabetic nephropathy; CTGF; VEGF; vildagliptin

廣東省深圳市龍崗區(qū)科技發(fā)展資金2013年度課題資助項(xiàng)目(YS2013075)。

武紅梅，女，碩士，主任醫(yī)師,主要從事內(nèi)分泌及代謝疾病臨床與基礎(chǔ)研究?！?/p>

，E-mail： mingjingshen1962@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.013

A

1672-9455(2015)24-3645-03

2015-05-13

2015-08-21)