徐慧萍宋麗姿(山東省萊西市漁業(yè)技術(shù)推廣站　山東　萊西　266600)

草魚纖維素酶活性的研究

徐慧萍宋麗姿
(山東省萊西市漁業(yè)技術(shù)推廣站山東萊西266600)

1　引言

草魚是我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，近年來隨著我國水產(chǎn)飼料工業(yè)的發(fā)展及需求，人們對草魚的營養(yǎng)需求量及飼料配方進(jìn)行了不少研究，但在消化生理方面尤其是對纖維素酶的研究還是十分薄弱的。纖維素酶作為消化酶的一種，它具有獨(dú)特的功能，可催化難于利用的纖維素轉(zhuǎn)化成為易被機(jī)體消化、吸收利用的小分子物質(zhì)。對于草魚體內(nèi)是否能分泌纖維素酶的問題,一直存在爭議。因此，研究草魚纖維素酶有助于了解草魚對飼料中纖維素的消化利用情況，以便合理利用低值植物飼料資源，實現(xiàn)飼料配方的進(jìn)一步優(yōu)化和飼料成本的下降。同時還可為其他魚類營養(yǎng)生理的研究提供參考。為此，本文研究了草魚不同器官纖維素酶的分布，溫度、pH值對纖維素酶活力的影響，以及用灌喂土霉素法探討纖維素酶在腸道內(nèi)是內(nèi)源性，還是微生物產(chǎn)生。

2材料與方法

2.1試驗材料

草魚購于萊西水溝頭市場，共26尾，體長30-45cm，體重0.996-2.107kg。土霉素通用名為鹽酸土霉素，規(guī)格含量為1g(100萬IU),由四川齊全動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2.2試驗設(shè)計

2.2.1纖維素酶在草魚體內(nèi)的分布研究實驗設(shè)計

目的是探討草魚體內(nèi)有無纖維素酶,以及在不同器官(前腸、中腸、后腸、脾臟、肝胰臟、膽汁)中纖維素酶的分布情況。本實驗取4尾魚，將前腸、中腸、后腸、脾臟、肝胰臟、膽汁取出，稱重，制取酶液。每個樣品3次重復(fù)。采用羧甲基纖維素鈉法測定纖維素酶活力大小。

2.2.2纖維素酶的適宜反應(yīng)條件研究實驗設(shè)計

購買魚16尾，暫養(yǎng)于水族箱2h后取其內(nèi)臟，分別稱重并記錄，制取酶液。每個樣品3次重復(fù)。纖維素酶活力測定方法同上。

2.2.3纖維素酶來源初步研究實驗設(shè)計

土霉素屬四環(huán)族抗菌素，是一種廣譜抗菌藥，可抑制腸道中的微生物。因此，以灌喂蒸餾水作為對照組，通過灌喂土霉素測定腸道中纖維素酶活力的變化情況，對纖維素酶來源進(jìn)行初步探討。共取6尾魚灌喂，分別灌喂土霉素和蒸餾水，3h后取樣,灌喂量為1000ppm，1ml/50g魚體重土霉素，蒸餾水劑量同土霉素。

2.3酶液的制備

健康的草魚成魚從市場上買回，實驗前暫養(yǎng)于水族箱中2h后取樣。在冰盤中解剖活魚，取出內(nèi)臟，置于碎冰中（保持在0-4℃狀態(tài)下）.從肝胰臟、脾臟組織中隨機(jī)取出一部分組織塊，在電子天平（0.1mg）上稱重；取出膽囊，將膽囊表面的脂肪及其他組織剔除干凈，用蒸餾水沖洗膽囊外壁，再用脫脂棉球拭干，刺破囊壁，取出膽汁，稱重；除去腸道內(nèi)容物，用重蒸水洗凈腸內(nèi)壁，再用濾紙小心將多余水分吸干，分別稱重。將所取樣品分別加5倍重量的預(yù)冷重蒸水，在0~4℃玻璃勻漿器勻漿（膽汁除外）后，3500r/min離心20min，取上清夜作為粗酶提取液，置-40℃冰箱中冷凍保存，備用。

2.4纖維素酶活性測定方法和原理：

纖維素酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。測定原理是羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）經(jīng)纖維素酶作用后，生成還原糖，可與3,5-二硝基水楊酸(DNS)生成紅色絡(luò)合物，用比色法測定還原糖的多少，即可確定纖維素酶的活力。酶活單位的表示方法是：活性大小以每mg組織24℃每分鐘催化纖維素生成葡萄糖(μg)表示（μg/min）。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取分析純的無水葡萄糖250.0000mg，溶于蒸餾水中，定容至250毫升，吸取此液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml，分別定溶至50ml，再分別吸取上述溶液各2.5ml于試管中，各加3ml 3,5-二硝基水楊酸，煮沸15min，（另作一管對照，取2.5ml蒸餾水，3ml 3,5-二硝基水楊酸，同樣煮沸5min）。冷卻后，用72型分光光度計，在530nm波長下比色，記錄各管的光密度讀數(shù)，以光密度作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，（糖液分別含糖0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg）。

2.6纖維素酶活性的測定

活酶活性測定：加pH=5的檸檬酸緩沖液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于24℃水浴鍋中糖化30min，取出后立即于沸水浴中煮沸15min，冷卻后3000r/min離心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3,5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸顯色15min，冷卻后加重蒸水6ml （3ml），530nm處測葡萄糖含量。

死酶活性測定：取2ml（1ml）酶液置于沸水浴中加熱10min，冷卻后加入pH=5的檸檬酸緩沖液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于40℃水浴鍋中糖化30min，取出后立即冷卻后3000r/min離心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸顯色15min，冷卻后加重蒸水6ml（3ml），530nm處測葡萄糖含量。

吸取1ml蒸餾水，加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3ml，于沸水浴中煮沸15min，冷卻后加重蒸水6ml（3ml）作為空白對照組，與試驗管一起保溫比色。

讀出光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出還原糖量，并計算出酶活力。

2.7纖維素酶活性的計算公式

Cx酶活力＝B×A×1000/30min＝（還原糖）μg/min

B—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖毫克數(shù)

A—酶液稀釋倍數(shù)

2.8統(tǒng)計方法

采用SPSS12.0 for Windows軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3　結(jié)果

3.1纖維素酶在草魚不同器官的活性分布

纖維素酶活性分布順序是肝胰臟>脾臟>腸道>膽汁。在肝胰臟內(nèi)的活性及其顯著，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他部位。膽汁的活性不明顯。其在腸道的順序后腸>前腸>中腸，但差異不顯著（見表1）。

表1草魚不同器官纖維素酶的活性　　單位:μg/min

3.2溫度對纖維素酶的影響

本實驗測定了20℃到52℃水浴，以4℃為溫度梯度，對纖維素酶進(jìn)行了研究（見圖1-5）。從圖中可以看出，在這五種器官中隨著溫度的升高，纖維素酶的活性總體呈下降趨勢。在前腸20℃和28℃出現(xiàn)峰值。中腸和后腸均在20℃出現(xiàn)峰值。肝胰臟和脾臟均在24℃時出現(xiàn)峰值。表明20℃-24℃適合纖維素酶活性的發(fā)揮。在后面的實驗中可以選擇20℃-24℃作為纖維素酶活性測定的溫度條件。

3.3 pH值對纖維素酶活性的影響

在pH值3.6-7.2，纖維素酶在前腸、中腸、后腸中均有兩個峰值。前腸為6.0和7.2，后腸為6.4 和7.2，而在中腸為5.2和6.0（見圖6）。這與腸道的pH值偏于酸性弱堿性是大體相似的。在脾臟其活性最大為6.0，而在5.2時其活性僅次于6.0（見圖7）。pH值為4.8和6.4時，纖維素酶在肝胰臟的活性最大（見圖8）。由此可以認(rèn)為在酸性環(huán)境條件下有利于纖維素酶活性的發(fā)揮。

3.4灌喂土霉素法,初步探討草魚腸道纖維素酶的來源

本實驗采用灌喂蒸餾水作為對照組，以50g魚體重灌蒸餾水1ml為標(biāo)準(zhǔn)；土霉素濃度為1000ppm，1ml/50g魚體重，灌喂量同對照組。灌喂后3h取樣。后腸纖維素酶活性明顯下降，前腸和中腸的變化不明顯（見圖9）。

4分析與討論

目前,對魚類消化系統(tǒng)中是否存在纖維素酶尚有爭議。Migita等(1949)曾發(fā)現(xiàn)鯽魚(Carassius auratus)消化系統(tǒng)中有纖維素酶活動。吳婷婷等(1994)在鰱,鳙,草魚等魚類均已發(fā)現(xiàn)存在纖維素酶活性。沈文英等(2002，2003)對銀鯽纖維素酶進(jìn)行了有關(guān)研究。林浩然認(rèn)為在一些過河口性魚類的腸道中存在分泌纖維素酶的腸道細(xì)菌。最近,對蝦蟹等水產(chǎn)動物中存在纖維素酶進(jìn)行的大量研究。而Fish（1951）和Barrington（1957）曾認(rèn)為魚類沒有纖維素酶。

本實驗，在草魚腸道，脾臟，肝胰臟中發(fā)現(xiàn)纖維素酶。在肝胰臟中活性很大，脾臟次之，腸道中也有明顯活性。從實驗結(jié)果來看，對于草食性魚類飼料中應(yīng)當(dāng)添加適量的纖維素。

溫度、pH值對于魚類生理活動的影響是多方面的。沈文英等（2003）研究了魚類消化酶與溫度的關(guān)系，認(rèn)為溫度升高，魚類消化酶活性增強(qiáng),但此種正相關(guān)不是無限的。本實驗結(jié)果表明在溫度20℃-28℃之間時，腸道、脾臟和肝胰臟的纖維素酶活性較強(qiáng)。這一結(jié)果與草魚的最適生長溫度大致相吻合。而酸堿度的作用一方面是對食物進(jìn)行酸堿性消化，另一方面是為消化酶提供適宜的酸堿度利于纖維素酶活性的發(fā)揮。因此，在人工配合飼料生產(chǎn)中應(yīng)充分考慮飼料的成分及對其消化利用。本實驗結(jié)果腸道在偏酸性、弱堿性時的纖維素酶活性最大，而脾臟、肝胰臟在酸性條件下有利于纖維素酶，以提高飼料成分的消化吸收。

從實驗結(jié)果來看，草魚腸道內(nèi)的纖維素酶既有腸道自身分泌又有其內(nèi)部微生物產(chǎn)生。前腸和中腸微生物產(chǎn)生不明顯，而后腸灌喂土霉素組與對照組有明顯的差異，說明在草魚的后腸內(nèi)可能存在分泌纖維素酶的微生物或是能夠刺激纖維素酶產(chǎn)生的細(xì)菌，這還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)（略）