鄭華，計(jì)可為，周蓮清，孟春梅，蘇志恒*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣西　南寧　530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，廣西　南寧　530021)

甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及Cyt C易位表達(dá)的保護(hù)作用

鄭華1，計(jì)可為2，周蓮清2，孟春梅1，蘇志恒2*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，廣西南寧530021)

【摘要】目的：探索甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法：MTT法檢測(cè)正常對(duì)照組、棕櫚酸模型組、不同濃度甜茶素組細(xì)胞存活率，透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，免疫電鏡觀察各組細(xì)胞色素C的易位表達(dá)。結(jié)果：不同濃度甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞具有保護(hù)作用，超微結(jié)構(gòu)保存較好；模型組細(xì)胞凋亡增多且超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，Cyt C蛋白從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論：甜茶素可以提高棕櫚酸誘導(dǎo)INS-1損傷的細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制棕櫚酸引起的氧化應(yīng)激和阻礙Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】甜茶素；棕櫚酸；INS-1細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)；細(xì)胞色素C

廣西甜茶(RubussuavissimusS.Lee)為薔薇科懸鉤子屬多年生有刺灌木，民間主要用于糖尿病和肥胖癥的治療，甜茶素是甜茶葉中最具價(jià)值的成分[1-2]。近年有研究報(bào)道[3]胰島素抵抗導(dǎo)致的血脂水平紊亂可使胰島β細(xì)胞處于持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡。有研究表明，甜茶素能顯著降低高脂飲食模型大鼠血糖水平[4]，但具體作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道?；诖耍覀円宰貦八崮M機(jī)體胰島素抵抗所導(dǎo)致的高血脂產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，并應(yīng)用透射電鏡和免疫電鏡技術(shù)，觀察甜茶素干預(yù)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞INS-1后亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)表達(dá)的影響，探討甜茶素抑制脂毒性的作用機(jī)制，為開發(fā)防治糖尿病新藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株大鼠胰島細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，資源編號(hào)為3111C0001CCC000378。

1.2藥物與試劑棕櫚酸、甜茶素(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；兔抗Cyt C多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG膠體金10nm(武漢博士德生物試劑有限公司)；LR White樹脂(英國(guó)RESIN公司)；其余試劑均為分析純。

1.3儀器CO2培養(yǎng)箱；-20℃，-80℃冰箱(日本Sanyo公司)；UC6徠卡超薄切片機(jī)；紫外線聚合箱(中鏡科儀公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.4細(xì)胞模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INS-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，含3×104個(gè)細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3h，使各孔細(xì)胞同步化。按隨機(jī)原則分為6組：①正常對(duì)照組，不加任何處理因素；②棕櫚酸模型組：在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)48h；③甜茶素干預(yù)組：在細(xì)胞培養(yǎng)基中先加入不同濃度(25、50、100、200μmol/L)的甜茶素培養(yǎng)48h，再加入終濃度為0.5mmol/L棕櫚酸繼續(xù)培養(yǎng)48h。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5細(xì)胞存活率的檢測(cè)細(xì)胞存活率應(yīng)用MTT法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h加入MTT(5g/L，每孔20μl)繼續(xù)孵育4h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇492nm的波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔吸光值(A)，記錄結(jié)果。計(jì)算存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值×100%)。

1.6透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)收集各組細(xì)胞，離心成團(tuán)，經(jīng)3%戊二醛前固定，鋨酸后固定，乙醇梯度脫水(50%、70%、80%、90%、)，乙醇丙酮1∶1(濃度為90%)脫水，100%丙酮脫水3次，用618包埋劑、DDSA、DBP、DMP-30調(diào)和劑滲透包埋，烘箱烤制(38℃ 12h，45℃12h，60℃48h)，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛分別染色5min，日立H-7650電鏡下觀察。

1.7免疫電鏡觀察Cyt C蛋白的分布收集各組細(xì)胞離心成團(tuán)，于4%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定2h之后，4%甘氨酸封閉醛基30min，-20℃下依次30%、50%、70%乙醇脫水，在-20℃冰箱中依次用LR White樹脂+加速劑：70%乙醇(2∶1)、100%LR White樹脂滲透，再用100%LR White樹脂滲透過夜。在4℃下用純的LR White樹酯包埋，在-20℃冰箱中用長(zhǎng)紫外線(360nm)照射聚合72h，然后在室溫下繼續(xù)照射聚合48h。超薄切片，用鎳網(wǎng)撈片。對(duì)超薄切片進(jìn)行封閉非特異性結(jié)合的處理，室溫下5min，然后依次加入一抗孵育過夜，二抗膠體金孵育2h，經(jīng)PBS漂洗后常規(guī)染色，干燥待鏡。

2結(jié)果

2.1甜茶素對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響

表1　 不同濃度甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率的影響　±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與棕櫚酸組比較，#P<0.05。

2.2各組INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變由圖1可知，正常對(duì)照組INS-1細(xì)胞胞質(zhì)見豐富的粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，內(nèi)見多個(gè)胰島素分泌顆粒，線粒體膜完整，嵴清晰，核染色質(zhì)分布均勻。棕櫚酸組INS-1細(xì)胞胞質(zhì)線粒體腫脹疏松化、嵴斷裂，空泡樣變明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張嚴(yán)重，核糖體脫落，細(xì)胞核碎裂、核溶解，核染色質(zhì)邊集，凋亡小體生成，胰島素顆粒分泌減少；甜茶素50μmol/L組INS-1細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體較豐富，可見較多胰島素分泌顆粒，核膜完整，核染色質(zhì)分布較均勻，未見凋亡小體；甜茶素25μmol/L和100μmol/L組可見INS-1細(xì)胞粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常，個(gè)別線粒體嵴不完整，胰島素分泌顆粒較多，未見凋亡小體，與棕櫚酸模型組比較，各用藥組INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善。

2.3Cyt C蛋白在INS-1細(xì)胞中的分布由圖2可知，正常對(duì)照組可見INS-1細(xì)胞線粒體內(nèi)可見大量Cyt C蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為有大量簇狀黑色膠體金顆粒分布于線粒體膜旁，而棕櫚酸模型組INS-1細(xì)胞線粒體里幾乎看不見膠體金顆粒，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相反，棕櫚酸模型組INS-1細(xì)胞在線粒體外的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多膠體金顆粒，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甜茶素各劑量組INS-1細(xì)胞線粒體內(nèi)可見較多膠體金顆粒，線粒體外的細(xì)胞質(zhì)有少量膠體金顆粒，與棕櫚酸模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以甜茶素50μmol/L組最為明顯。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)氧自由基代謝參與了糖尿病的發(fā)生與發(fā)展，高糖高脂對(duì)胰島β細(xì)胞有協(xié)同破壞作用，增高的血漿游離脂肪酸可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種由游離脂肪酸引起的細(xì)胞凋亡稱為“脂性凋亡”[5]。脂毒性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生過多的氧自由基，啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的凋亡刺激因子，造成胰島細(xì)胞的不可逆凋亡。因此臨床上必須重視脂毒性對(duì)胰島細(xì)胞的損傷，尋找天然無毒的抗氧化劑，將有助于2型糖尿病的臨床防治。廣西甜茶(RubussuavissirnusS.Lee)是最高甜度、低熱能且天然無毒的珍稀甜味植物，具有“藥、糖、茶”三重功效，是一種獲得美國(guó)FDA認(rèn)證的天然的糖類替代品和藥品。其主要成分甜茶素(rubusoside)是由斯替維醇和葡萄糖結(jié)合而成的四環(huán)二萜苷?，F(xiàn)代研究表明，甜茶素有一定的降血糖、降血脂和降血壓的作用，對(duì)肥胖癥、糖尿病、心血管病、高血壓等有一定療效[6-8]。但以往的研究都是對(duì)模型動(dòng)物來進(jìn)行研究，并沒有從亞細(xì)胞角度來深入探索甜茶素的作用機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量。外部因素的刺激可導(dǎo)致線粒體功能下降，呼吸鏈斷裂，成為ROS生成的主要來源[9]。調(diào)控細(xì)胞凋亡有三種途徑：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。線粒體是多種促細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點(diǎn)，同時(shí)也是細(xì)胞死亡通路的整合元件，被稱作細(xì)胞凋亡的生死開關(guān)，大多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途經(jīng)[10]。因此，線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變和線粒體內(nèi)的蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。Cyt C是線粒體呼吸鏈中的一種電子傳遞體，作為一種促凋亡信號(hào)蛋白，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[11]。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，對(duì)線粒體能量代謝起著重要調(diào)節(jié)作用，凋亡信號(hào)刺激導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變或者蛋白復(fù)合孔的形成，使其從線粒體釋放至細(xì)胞胞漿，結(jié)合胞漿中的Apaf-1 (apoptoticprotease activating factor-1)后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：Cyt C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。免疫電鏡技術(shù)是免疫組織化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)的結(jié)合，研究抗原抗體在亞細(xì)胞定位的技術(shù)。研究通過免疫電鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在棕櫚酸的作用下，INS-1細(xì)胞線粒體嵴斷裂，空泡樣變，Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞胞漿，從而啟動(dòng)一系列caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使INS-1細(xì)胞凋亡增加，而各劑量甜茶素組線粒體膜較完整，嵴基本完好，大部分Cyt C蛋白還是結(jié)合在線粒體上，沒有觀察到凋亡小體，其中以甜茶素50μmol/L組的保護(hù)作用最好。因此，研究認(rèn)為甜茶素對(duì)INS-1細(xì)胞具有抗氧化保護(hù)作用，其機(jī)制可能為阻礙Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞胞漿，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，減少細(xì)胞的凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)糖基化修飾以及Ca2+的儲(chǔ)存與分布的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與類固醇激素的合成和糖類和脂類的代謝等。細(xì)胞在脂毒性產(chǎn)生的多種氧自由基和凋亡因子的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及Ca2+代謝紊亂而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究發(fā)現(xiàn)，ERS在介導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡中起重要作用，并可能與肥胖胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。本研

究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸模型組INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，核糖體脫落，可見細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生了嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，未折疊蛋白增多、Ca2+超載，激活鈣調(diào)蛋白calpain從而激活下游的caspase，引起INS-1細(xì)胞凋亡。在甜茶素各劑量組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的現(xiàn)象得到了改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)類似于正常的INS-1細(xì)胞，表明甜茶素可以逆轉(zhuǎn)高脂狀態(tài)對(duì)這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，拮抗棕櫚酸的氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，研究以棕櫚酸作用于體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血脂代謝障礙產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，并應(yīng)用甜茶素進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)甜茶素對(duì)棕櫚酸干預(yù)下的胰島細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞具有保護(hù)作用，最佳保護(hù)濃度為50μmol/L。其保護(hù)機(jī)制可能為阻礙Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位入細(xì)胞胞漿，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)脂毒性對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)破壞嚴(yán)重，而各劑量組的甜茶素均能夠有效的保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程中甜茶素是否逆轉(zhuǎn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所產(chǎn)生的凋亡信號(hào)，值得進(jìn)行下一步的研究。

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Protective Effects of Rubusoside on the Ultrastructure and Cyt C Translocation

Expression of the Palmitic Acid-induced INS-1 Cells

ZHENG hua1,JI Kewei2,ZhouLianqing2,MENG Chunmei1, SU Zhiheng2*

1.Medical Scientific Research Center of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China;

2.School of pharmaceutical science, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective mechanism of Rubusoside treating on the palmitic acid-induced INS-1 cells.Methods MTT assay was used to detect the cell viability rate of control group, palmitic acid group and different concentrations of Rubusoside group.Transmission electron microscope(TEM) was used to observe the ultrastructur of every group and the immune electron microscopy was used to detect cytochrome C translocationexpression.Results As evidenced by MTT assay, the cell viability significantly was enhanced by different concentrations Rubusoside pretreatment. TEM revealed degenerative changes in the ultramicroscopic structure of palmitic acid-induced INS-1 cells whereas various concentrationpretreatment with Rubusoside could significantly attenuated the deterioration of the damage. Immune electron microscopy showed that different concentrations Rubusoside could prevent the cytochrome C releasing from mitochondria to cytoplasm with palmitic acid induced.Conclusion Rubusoside can improve the survival rate of palmitic acid-induced INS-1 cells and inhibit the occurrence of apoptosis.It is suggested that the mechanism may be associated with the inhibition of the oxidative stress induced by palmitic acid and prevent the cytochrome C releasing from mitochondrial to cytoplasm, which can activate caspase cascade and a downstream signaling to apopotosis.

Key words:Rubusoside;palmitic acid;INS-1 cell;ultrastructure;cytochrome C

(收稿日期：2015.09.07)

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2015)24-0016-04

作者簡(jiǎn)介：鄭華(1980-)，女，漢族，醫(yī)學(xué)博士，主要從事糖尿病天然藥物代謝組學(xué)研究。通信作者：蘇志恒(1981-)，男，漢族，生物學(xué)博士，副教授，主要從事藥物代謝組學(xué)研究。E-mail:suzhiheng1981@126.com

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFBA053108);廣西醫(yī)科大學(xué)“未來學(xué)術(shù)之星”大學(xué)生課外創(chuàng)新科研課題(WLXSZX16022);廣西醫(yī)科大學(xué)青年基金(GXMUYSF18)。