徐巧元，楊志祥，羅 闊

(1.重慶市第五人民醫(yī)院腫瘤科 400062；2.重慶市中山醫(yī)院腫瘤科400013)

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·論 著·

負載抗原的DC與CIK共培養(yǎng)對多藥耐藥肝癌細胞HepG2/ADM的殺傷作用及其機制研究

徐巧元1，楊志祥2△，羅 闊2

(1.重慶市第五人民醫(yī)院腫瘤科 400062；2.重慶市中山醫(yī)院腫瘤科400013)

目的 觀察負載抗原的樹突狀細胞(DC)與細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)對高表達P-糖蛋白(P-gp)的多藥耐藥(MDR)的肝癌細胞株HepG2/ADM細胞的殺傷作用和機制研究。方法 用常規(guī)方法誘導健康志愿者外周血中單個核細胞產(chǎn)生DC和CIK細胞，制備HepG2/ADM細胞凍融抗原后沖擊DC，并與CIK細胞分別共培養(yǎng)24、48、72、96 h，并將未負載抗原的DC和CIK細胞共培養(yǎng)作為對照。采用流式細胞術鑒定DC、CIK細胞的表型，采用CCK-8試劑檢測HepG2/ADM細胞的增殖活力。用RT-PCR檢測各組細胞內(nèi)mdr-1 mRNA的水平變化，Western blot檢測細胞內(nèi)P-gp蛋白水平的變化。結(jié)果 與未負載抗原的DC-CIK相比，負載抗原的DC-CIK表面分子表達明顯增高(P<0.05)，對HepG2/ADM細胞增殖活力抑制作用更加明顯(P<0.05)。RT-PCR和Western blot結(jié)果分別顯示，隨著作用時間的延長，未負載抗原的DC-CIK和負載抗原DC-CIK的HepG2/ADM細胞內(nèi)的mdr-1 mRNA和P-gp蛋白水平分別都有明顯的降低(P<0.05)，而且后者的抑制作用更明顯(P<0.05)。結(jié)論 經(jīng)抗原沖擊的DC和CIK共培養(yǎng)可以明顯提高對多藥耐藥HepG2/ADM細胞株的殺傷活性，其機制可能與抑制與MDR密切相關的mdr-1基因和及其編碼的P-gp蛋白水平有關。

細胞因子誘導的殺傷細胞; 樹突狀細胞; 多藥耐藥; P-糖蛋白； HepG2/ADM細胞

樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)已知功能最強、唯一能活化靜息T細胞的專職抗原提呈細胞。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)一種新型的免疫活性細胞，它是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞。研究表明，CIK和DC兩者共培養(yǎng)后具有更強的增殖活性和細胞毒性，能刺激機體的免疫系統(tǒng)，誘導產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應，從而達到治療腫瘤的目的。目前DC聯(lián)合CIK細胞免疫治療在多種實體腫瘤和血液系統(tǒng)疾病中得到令人鼓舞的效果，而對于肝癌細胞多藥耐藥性調(diào)節(jié)方面報道較少，故本研究欲將CIK 細胞與負載耐藥肝癌HepG2/ADM細胞凍融抗原的DC細胞共培養(yǎng)，觀察其對細胞殺傷性的影響，并探討其機制[1-3]。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系 DC和CIK細胞取自健康志愿者的外周血，HepG2肝癌細胞株來自重慶醫(yī)科大學分子與腫瘤研究中心，并建立由阿霉素誘導的多藥耐藥細胞株HepG2/ADM。

1.2 儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司；人淋巴細胞分離液為TBS產(chǎn)品；RHGM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-4購自廈門特寶生物工程股份有限公司；CD3單克隆抗體(CD3McAb)購自深圳達科為生物有限公司；FITC標記的CD3、CD8、CD56、CD80、CD83、CD86和主要組織相容性復合體Ⅱ(MHCⅡ)單克隆抗體購自美國eBioscience公司；IL-2和IFN-γ的ELISA試劑盒購自博士德生物公司；CCK-8試劑盒購自日本株式會社；Annexin V-FITC/PI 購自凱基生物。RT-PCR試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司，mdr-1引物由Invitrogen公司設計并合成。P-gp單克隆抗體購自Santa Cruz公司，內(nèi)參抗體β-actin購自博鰲森生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞凍融抗原的制備 常規(guī)收集對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞，磷酸緩沖液(PBS)沖洗3遍后，再用PBS稀釋將濃度調(diào)整至1×108/mL，制成細胞懸液。在-80 ℃冰凍，后于37 ℃融解，如此反復凍融3次，再于冰浴中超聲波破碎，以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，過濾除菌，存放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DC和CIK細胞的誘導培養(yǎng)和共培養(yǎng) 取自于健康志愿者的外周血，經(jīng)血細胞分離機和淋巴細胞分離液梯度離心法分離純化單個核細胞。用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5×106/mL，加入6孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。收集培養(yǎng)上清中的懸浮細胞作為誘導CIK細胞備用。用含有1 000 U/mL CM-CSF、500 U/mL IL-4、500 U/mL TNF-α以及10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞。每3天換1次液，在第4天，向一部分DC培養(yǎng)液中按100 U/mL加入凍融抗原，誘導至第7天收獲成熟DCs。將收集的懸浮細胞密度調(diào)整至2×106/mL加入6孔板中，用含50 ng/mL 抗CD3單抗、2 000 U/mL IFN-γ、1 000 U/mL IL-2以及10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換1次液，誘導至14 d收獲CIK細胞。將收獲的負載抗原和未負載抗原的DC分別與CIK細胞共培養(yǎng)(DC∶CIK=1∶100)，采用CIK培養(yǎng)液，分別命名為Ag-DC-CIK和DC-CIK。共培養(yǎng)4 d后，收集細胞備用。

1.3.3 流式細胞術鑒定DC和CIK細胞的免疫表型 共培養(yǎng)4 d的DC以及CIK細胞，用PBS將細胞密度調(diào)整至1×106/mL，分別加入相應的抗體，混勻后在室溫下避光孵育30 min，再用PBS洗滌3遍，加入1%多聚甲醛固定。采用流式細胞儀檢測DC表型(CD80、CD83、CD86、MHCⅡ)和CIK表型(CD3、CD8、CD56)。

1.3.4 CCK-8檢測共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞的殺傷作用 將處于對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞以1×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，將DC-CIK細胞或Ag-DC-CIK細胞加入HepG2/ADM培養(yǎng)體系中(效靶比1∶1、10∶1、100∶1)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h。在培養(yǎng)相應時間點后加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，于酶標儀上490 nm處比色。根據(jù)公式計算細胞活力：細胞活力=A490(處理組)/A490(自然生長組)×100%。

1.3.5 RT-PCR 收集DC-CIK細胞或Ag-DC-CIK細胞共培養(yǎng)的各組HepG2/ADM細胞，PBS充分洗滌后，參照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，用RT-PCR法檢測各組細胞中mdr-1基因的表達量。Mdr-1上游引物：5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA GC-3′；下游引物：5′-CAA ACT TCT GCT CCT GAG TC-3′，擴增產(chǎn)物大小為167 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′；下游引物：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′，擴增產(chǎn)物大小為228 bp。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸5 min,35個循環(huán);72 ℃ 延伸7 min。擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳,凝膠成像掃描。用Quantity One灰度分析軟件進行吸光度值計算。以目的基因mdr-1條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為mdr-1 mRNA的表達量，并重復3次。

1.3.6 Western blot 收集各組細胞提取總蛋白，并測定蛋白的濃度為(2.12±0.24)mg/mL。取蛋白樣品20 μL，經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉TBST液封閉后，加入P-糖蛋白(P-gp)抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h后，ECL底物化學發(fā)光顯色后曝光顯影。通過Chemi DocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)，進行曝光分析，然后計算其比值表示結(jié)果，即：相對吸光度=目的蛋白P-gp吸光度/β-actin蛋白吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 DC與Ag-DC細胞的免疫表型的比較 在DC誘導培養(yǎng)7 d后，分別收集DC和Ag-DC，采用流式細胞術鑒定DC表面標志物CD80、CD83、CD86、MHCⅡ，結(jié)果見表1。DC分別為：(24.13±2.31)%、(18.77±0.63)%、(33.99±1.53)%、(32.02±2.30)%，而Ag-DC分別為：(42.42±2.27)%、(36.08±2.10)%、(36.66±2.10)%、(42.39±2.55)%。因此，結(jié)果顯示DC負載抗原后，表面標志物的表達均有上升，且2組間CD80、CD83以及MHCⅡ的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 誘導7 d后DC與Ag-DC細胞的免疫表型的表達量

注：DC組與Ag-DC組比較，*P<0.05。

2.2 與DC或Ag-DC共培養(yǎng)后CIK細胞的免疫表型比較 在DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)4 d后，收集2組CIK細胞，采用流式細胞術進行表型鑒定，DC-CIK組的CIK細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞分別為(25.79±1.70)%、(8.94±0.63)%，而Ag-DC-CIK組的CIK細胞分別為(32.48±1.00)%、(13.97±1.25)%。該結(jié)果提示，負載抗原的DC比未負載抗原的DC更能提高CD3+CD8+CIK和CD3+CD56+CIK的百分比。見表2。

表2 共培養(yǎng)4 d后2組CIK細胞的免疫表型

注：DC-CIK組與Ag-DC-CIK組比較，*P<0.05。

2.3 DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞的殺傷作用 將DC-CIK或Ag-DC-CIK按效靶比分別為1∶1、10∶1、100∶1與肝癌細胞HepG2/ADM共培養(yǎng)，采用CCK-8試劑檢測2組共培養(yǎng)細胞對肝癌細胞增殖活力的殺傷作用。當效靶比為1∶1時，無論作用多長時間，2組HepG2/ADM細胞增殖活力下降均不明顯。當效靶比為10∶1時，2組共培養(yǎng)細胞在48 h出現(xiàn)殺傷作用，隨著作用時間延長，HepG2/ADM細胞增殖活力下降越明顯(P<0.05)，且Ag-DC-CIK組的細胞活力明顯低于DC-CIK組(P<0.05)。當效靶比在100∶1時，共培養(yǎng)細胞的殺傷作用更強，Ag-DC-CIK組在24 h就使HepG2/ADM細胞增殖活力下降至(81.8±4.67)%，當作用時間至96 h，DC-CIK組的HepG2/ADM細胞活力大大降低至(42.23±3.01)%，甚至在Ag-DC-CIK組僅剩(19.14±2.06)%。該結(jié)果顯示，效靶比在1∶1到100∶1范圍內(nèi)時，共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞的殺傷作用與效靶比呈正相關，且具有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且Ag-DC-CIK細胞抗癌作用明顯優(yōu)于DC-CIK組(P<0.05)。見表3。

表3 共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞的殺傷作用

注：與自然生長組比較，*P<0.05；與相同效靶比的DC-CIK組比較，△P<0.05。

2.4 DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達的影響 根據(jù)前面的實驗結(jié)果，將DC-CIK和Ag-DC-CIK按效靶比為10∶1與肝癌細胞HepG2/ADM共培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h后收集各組細胞。采用RT-PCR法和凝膠電泳成像分析，在DC-CIK與HepG2/ADM共培養(yǎng)72 h后，細胞內(nèi)mdr-1 mRNA的表達量才有明顯的下降，作用96 h后，其表達下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在Ag-DC-CIK與HepG2/ADM共培養(yǎng)48 h后，細胞內(nèi)mdr-1 mRNA的表達已有明顯降低，且隨著作用時間的延長，細胞內(nèi)的mdr-1 mRNA下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具有時間依賴性。而且，在48 h時，與DC-CIK比較，Ag-DC-CIK對HepG2/ADM細胞內(nèi)mdr-1 mRNA的抑制作用較更明顯(P<0.05)。見圖1、表4。

注：A表示Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達的影響；B表示DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達水平的比較。

圖1 DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達的影響和比較

注：與0 h組相比，*P<0.05，**P<0.01；Ag-DC-CIK組與DC-CIK組相比，§P<0.01。

2.5 DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白表達水平的影響 將DC-CIK和Ag-DC-CIK按效靶比為10∶1與肝癌細胞HepG2/ADM共培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h后收集各組細胞。采用WB法和凝膠成像分析，在DC-CIK與HepG2/ADM共培養(yǎng)48 h后，細胞內(nèi)P-gp蛋白的表達量有明顯的下降，作用72、96 h后，其表達下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；在Ag-DC-CIK與HepG2/ADM共培養(yǎng)48 h后，細胞內(nèi)P-gp蛋白的表達也有明顯降低，且隨著作用時間的延長，細胞內(nèi)的P-gp蛋白表大量下降更明顯，具有時間依賴性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而且，在72 h后，與DC-CIK比較，Ag-DC-CIK對HepG2/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白水平的抑制作用更明顯差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表5。

注：A表示Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白表達水平的影響；B表示DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白表達水平的比較。

圖2 DC-CIK和Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細胞對肝癌HepG2/ADM細胞內(nèi)P-gp蛋白表達水平的影響和比較

注：與0 h組比較，#P<0.05，##P<0.01；Ag-DC-CIK組與DC-CIK組比較，§P<0.01。

3 討 論

多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對結(jié)構和作用機制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉抗藥性，從而極大地降低了抗腫瘤藥物的療效。MDR的發(fā)生是許多種腫瘤化療失敗的主要原因，其形成的機理復雜多樣，而多藥耐藥基因mdr1編碼的P-gp過度表達是其重要原因之一，P-gp能夠?qū)⒂H脂類化療藥物泵出細胞外，從而導致耐藥特性[4]。Mdr-1和P-gp在多種惡性腫瘤細胞中的過度表達是形成MDR的重要機制，也是腫瘤患者化療效果差、預后差、復發(fā)率高的重要原因，因此尋找有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑一直是抗腫瘤研究的熱點[5-6]。

肝癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，針對因糖蛋白P-gp高表達引發(fā)MDR而導致的肝癌居高不下的發(fā)病率和死亡率，各種新型的治療策略正在迅速地被發(fā)掘，其中細胞免疫治療因其能提高肝癌患者的生存率和降低復發(fā)率而備受臨床醫(yī)生和患者的青睞。

CIK是一類具有非MHC限制性的T細胞，具有強大的光譜的殺瘤效應，如肺癌、胃癌、乳腺癌等，而其主要的效應細胞給CD3+和CD6+淋巴細胞[7-9]。DC分布于全身各處，它具有強大的抗原呈遞作用，它能激活初始型的T細胞增殖并建立初級免疫應答。DC在體外可以通過多種細胞因子誘導生成。將DC與CIK共培養(yǎng)，前者可識別病原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，后者通過發(fā)揮自身的細胞毒性與分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，因此能夠提高CIK的抗瘤療效。因此，在本研究中，通過利用DC-CIK聯(lián)合培養(yǎng)，然后作用于多藥耐藥肝癌細胞株HepG2/ADM，效靶比在100∶1時，顯示出了強大的抗肝癌細胞增殖作用，此種抗瘤作用隨時間延長而增強，并持續(xù)到96 h，具有時間依賴性。其可能的機制為DC表面有大量的樹突狀突起，使之有利于大量接觸抗原，提呈給T細胞;高表達MHCⅠ、Ⅱ類分子及CD80/CD86等共刺激分子，為CIK細胞充分活化提供了有效的刺激，分泌出多種細胞因子，包括IL-12、IFN等，維持和增強CIK細胞的殺傷作用。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，DC-CIK聯(lián)合培養(yǎng)后能夠顯著降低mdr-1 mRNA水平的表達及其編碼的P-gp蛋白水平的表達，而且這種抑制作用也呈現(xiàn)時間依賴性(P<0.05)。

DC除能刺激初始型T細胞活化增殖外，還能把抗原有效的呈遞給T細胞，使T細胞對抗原蛋白酶致敏，從而殺死腫瘤細胞。將腫瘤細胞全部抗原信息(如提取的腫瘤細胞總RNA或經(jīng)過滅活的完整的腫瘤細胞)沖擊DC，可以有效地致敏和活化DC，促進其分化成熟，增強其功能，因此，將負載有抗原的DC-CIK共培養(yǎng)，可以提高CIK的抗瘤能力[10]。在本研究中，將肝癌HepG2/ADM細胞反復凍融制作的抗原負載于DC上，DC表面的共刺激分子(CD80、CD83和CD86)、MHCⅡ、CD3+CD8+和CD3+CD56+的表達均高于未負載抗原的DC，說明負載了抗原的DC，其成熟度更高，抗原呈遞功能更強。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，與未負載抗原的DC-CIK比較，負載抗原組的抗瘤作用明顯強于未負載抗原組，且效靶比在10∶1和100∶1時差異有統(tǒng)計學意義，此種差異隨著作用時間延長而漸顯明顯(P<0.05)；且細胞內(nèi)mdr-1 mRNA水平的表達以及其編碼的P-gp蛋白水平的表達明顯降低，也呈現(xiàn)時間依賴性(P<0.05)。

目前，負載有特異性的抗原DC瘤苗已運用于臨床，此種瘤苗作為強有力的宿主免疫刺激物，具有超強的免疫應答激發(fā)功能，能特異性的殺死腫瘤細胞，提高治療效果并無明顯毒副作用[11]。在本研究中，采用HepG2/ADM凍融抗原負載的DC-CIK，產(chǎn)生了比未負載抗原的DC-CIK細胞更有效殺傷mdr-1和P-gp高表達的多藥耐藥肝癌細胞HepG2/ADM的效應，這為肝癌的綜合治療指出了新的方向。

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Killing effects of co-culture of antigen-loaded DC and CIK cells on multidrug resistant liver cancer HepG2/ADM and its potential mechanism*

XUQiao-yuan1,YANGZhi-xiang2△,LUOKuo2

(1.DepartmentofOncology,ChongqingFifthPeople′sHospital,Chongqing400062,China;2.DepartmentofOncology,ChongqingZhongshanHospital,Chongqing400013,China)

Objective To observe the killing effects of the antigen-loaded dendritic cells(DC) and cytokine-induced killer cells(CIK) on multidrug resistance liver cancer line HepG2/ADM with highly expressed permeability glycoprotein(P-gp) and to explore its potential mechanisms.Methods DC cells and CIK cells were induced from the peripheral blood in healthy volunteers ′by the conventional methods,and DC cells were impacted with HepG2/ADM cells after frozen-thawed antigen,which were co-cultured with CIK cells for 24,48,72,96 h respectively.The DC cells without antigen-loading and CIK cells were co-cultured as control.The cell phenotype of DC and CIK was identified by the flow cytometry,the cell proliferation vitality of HepG2/ADM was detected by CCK-8;The expression of mdr-1 mRNA was determined by realtime-PCR,the P-gp protein level was detected by Western blot.Results Compared with non-antigen-loaded DC-CIK group,the expression of surface molecules in the antigen-loaded DC-CIK group was significantly increased(P<0.05),the vitality of HepG2 cells was inhibited more significantly(P<0.05).The RT-PCR and Western blot results showed that with the time extension,the expression of mdr-1 mRNA and P-gp protein both were significantly decreased in the above two groups respectively(P<0.05);Furthermore,the inhibitory effects was more significant in the antigen-loaded group(P<0.05).Conclusion The co-culture of DC and CIK after antigen impact could improve its killing activity to multidrug-resistant HepG2/ADM cell line,its potential mechanism may be via inhibiting the MDR closely related mdr-1 gene expression and its encoded P-gp protein level.

cytokine-induced killer cells； dendritic cells； multidrug-resistance； P-gp； HepG2/ADM cells

重慶市渝中區(qū)科技計劃項目(20120225)。

徐巧元，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤學方面的研究。△

，E-mail：yzhixiang122@tom.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.009

A

1672-9455(2015)15-2161-04

2015-02-28

2015-05-15)