溫路生，孟加榕，唐忠輝，黃仲慶，郭以河，潘羨心

(1.中國(guó)人民解放軍第一七五醫(yī)院/廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,福建漳州 363000；2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建漳州 363000)

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·論 著·

不同類(lèi)型人乳頭瘤病毒多重感染與宮頸病變的相關(guān)性研究

溫路生1，孟加榕1，唐忠輝2△，黃仲慶2，郭以河1，潘羨心1

(1.中國(guó)人民解放軍第一七五醫(yī)院/廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,福建漳州 363000；2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建漳州 363000)

目的 探討不同類(lèi)型人乳頭瘤病毒(HPV)多重感染與宮頸病變的相關(guān)性。方法 應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)200例宮頸病變患者石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行24種HPV基因型進(jìn)行檢測(cè)，以組織病理學(xué)診斷作為宮頸病變確診的金標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。結(jié)果 200例標(biāo)本中，HPV總感染率為51.50%(103/200)，其中慢性宮頸炎、鱗狀上皮內(nèi)低度病變(CIN1)、鱗狀上皮內(nèi)高度病變(CIN3)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌的HPV感染率分別為22/57(38.60%)、12/33(36.36%)、44/81(54.32%)、25/29(86.21%)，與宮頸病變密切相關(guān)(P<0.01)；不同宮頸病變中單一HPV感染率明顯高于多重HPV感染率(P<0.05)；高危型單一感染組HPV感染率與宮頸病變不相關(guān)(P>0.05)，多重感染、高危型感染、高危型多重感染、低危型多重感染、高低混合型多重感染的各組HPV感染率在不同級(jí)別宮頸病變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 HPV感染率與宮頸病變的不同程度密切相關(guān)，持續(xù)高危型感染HPV和多重感染HPV是加重宮頸病變的重要因素。

人乳頭瘤病毒； 多重感染； 宮頸病變

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)與宮頸癌的主要原因，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究焦點(diǎn)，HPV感染的基因型與感染持續(xù)時(shí)間與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，HPV多重感染是否增加和促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，目前尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)。本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)手術(shù)切除宮頸石蠟組織進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)，同時(shí)對(duì)手術(shù)切除宮頸石蠟組織進(jìn)行病理診斷，旨在了解漳州地區(qū)女性HPV感染在宮頸不同病變中分布，探討HPV感染類(lèi)型在宮頸癌及癌前病變發(fā)生、發(fā)展中的作用，為該地區(qū)宮頸癌防治提供依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年9月解放軍第一七五醫(yī)院宮頸病變患者石蠟組織標(biāo)本200例，其中慢性宮頸炎57例、鱗狀上皮內(nèi)低度病變(CIN1)33例、鱗狀上皮內(nèi)高度病變(CIN3)81例、宮頸鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)宮頸鱗癌)29例，患者年齡18～73歲，平均年齡(43±9)歲。

1.2 儀器與試劑 DNA提取和檢測(cè)人乳頭瘤病毒分型試劑盒及等離子表面振諧技術(shù)(SPR)HPV基因分型檢測(cè)儀購(gòu)自金菩嘉公司。檢測(cè)基因型包括16種高危型(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，81)和8種低危型(HPV 6，11，40，42，43，44，54，70)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 用專(zhuān)用切片機(jī)厚8 μm連續(xù)切片(視組織大小)4～10張，滅菌鑷子取下放入1.5 mL EP管中；加入200 μL石蠟裂解液，95 ℃裂解10 min；在石蠟?zāi)糖耙?2 000 r/min離心2 min；穿過(guò)石蠟層加入10 μL蛋白酶K，混勻，56 ℃水浴過(guò)夜消化組織；第2天取出EP管95 ℃ 10 min滅活蛋白酶K；在石蠟?zāi)糖耙?2 000 r/min離心3 min，分離石蠟層和DNA模板層；石蠟層下水層為DNA模板層用于PCR。

1.3.2 PCR擴(kuò)增HPV DNA循環(huán) 每例樣本取DNA 5 μL與95 μL試劑盒內(nèi)的體系液加入200 μL的EP管中，混勻，PCR反應(yīng)循環(huán)程序按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。預(yù)溫：50 ℃，2 min；預(yù)變性：94 ℃，4 min；擴(kuò)增(28循環(huán))：變性94 ℃，30 s，退火48 ℃，45 s，延伸72 ℃，20 s；擴(kuò)增(25循環(huán))：變性94 ℃，30 s，退火65 ℃，45 s，延伸72 ℃，20 s；冷卻：4 ℃。

1.3.3 檢測(cè) PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入60 μL雜交緩沖液和20 μL的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，混勻，95 ℃雜交5 min，將EP換成軟蓋，按照儀器說(shuō)明書(shū)步驟在SPR檢測(cè)儀上對(duì)樣本進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV基因型檢測(cè)結(jié)果 200例宮頸病變患者檢查結(jié)果顯示HPV陽(yáng)性103例，感染率為51.50%(103/200)。慢性宮頸炎、CIN1、CIN2和宮頸鱗癌的HPV感染率分別為22/57(38.60%)、12/33(36.36%)、44/81(54.32%)、25/29(86.21%)，與宮頸病變密切相關(guān)(χ2=21.070，P=0.000)。隨著慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的宮頸癌變升級(jí)，HPV感染率呈明顯的升高趨勢(shì)，分別為22/57(38.60%)、56/114(49.12%)、25/29(86.21%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.043，P=0.000)，表明隨著癌變程度加重，其HPV感染率逐漸升高，其感染程度也明顯加重。

2.2 HPV感染類(lèi)型與宮頸病變的相關(guān)性 在不同宮頸病變中，單一感染組與多重感染組HPV感染率隨著宮頸病變加重而增加，慢性宮頸炎、CIN1、CIN3、宮頸鱗癌的HPV感染率分別為33.33%(19/57)、24.24%(8/33)、39.51%(32/81)、37.93%(11/29)、5.26%(3/57)、12.12%(4/33)、14.81%(12/81)、48.28%(14/29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.482，P=0.015)，其中單一感染組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.581，P=0.461)，而多重感染組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.103，P=0.000)。HPV感染率最高在宮頸鱗癌中高危型感染組為62.09%(18/29)，高危型單一感染組或低危型單一感染組或低危型感染組，與宮頸病變的嚴(yán)重程度呈不相關(guān)(χ2=2.423，P=0.489；χ2=3.120，P=0.346；χ2=3.196，P=0.330)，但高危型感染組與宮頸病變密切相關(guān)(χ2=10.230，P=0.017<0.05)，說(shuō)明持續(xù)高危型HPV感染會(huì)增加宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生。多重感染組、高危多重感染組、低危多重感染組、高低混合型多重感染組與宮頸病變呈密切相關(guān)(χ2=27.103，P=0.000；χ2=10.750，P=0.00；χ2=5.205，P=0.046；χ2=9.162，P=0.011)，說(shuō)明HPV多重感染在宮頸癌變過(guò)程中起促進(jìn)作用，若患者出現(xiàn)持續(xù)感染，則危險(xiǎn)性更大，更容易導(dǎo)致宮頸病變，增加宮頸癌的發(fā)生。見(jiàn)表1。

表1 HPV感染類(lèi)型與宮頸病變類(lèi)型的關(guān)系(n)

注：?jiǎn)我桓腥窘M與多重感染組比較，χ2=10.482，P=0.015；*為精確概率計(jì)算方法進(jìn)行分析。

3 討 論

HPV是一組無(wú)包膜的小DNA病毒，具有嗜上皮性、高度組織和宿主特異性，可致人類(lèi)皮膚和黏膜異常增生，引起多種良、惡性病變。宮頸病變是女性最常見(jiàn)的疾病之一，最嚴(yán)重者為宮頸癌。宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的較長(zhǎng)而連續(xù)發(fā)展的過(guò)程，即慢性宮頸炎→CIN1→CIN3→宮頸癌。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變患者總HPV感染率為51.50%，慢性宮頸炎、CIN1、CIN3和宮頸鱗癌患者的HPV感染率分別為38.60%、36.36%、54.32%、86.21%，與宮頸病變密切相關(guān)(P<0.01)。隨著慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的宮頸癌變升級(jí)，HPV感染率呈升高趨勢(shì)，分別為38.60%、49.12%、86.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明隨著癌變程度加重，其HPV感染率逐漸升高，其感染程度也明顯加重，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相似，進(jìn)一步論證了HPV感染與宮頸病變高度相關(guān)[1-4]。

女性生殖道HPV感染存在基因型單一感染與多重感染，但由于不同HPV基因型之間基本不存在交叉保持性抗體，容易造成HPV多重感染。HPV多重感染是否促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，目前存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為多重感染可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，并加大治療難度[5]。本研究中，在HPV基因型單一感染中，無(wú)論是高危型HPV基因型單一感染或低危型HPV基因型單一感染，與宮頸病變的嚴(yán)重程度無(wú)明顯相關(guān)性，說(shuō)明僅單一HPV基因型感染在宮頸癌變過(guò)程中不是起關(guān)鍵作用，即使是高危型HPV基因型感染。HPV多重感染占HPV感染患者32.04%，無(wú)論是高危型HPV多重感染或低危型HPV多重感染或高低危險(xiǎn)混合型多重感染，與宮頸病變的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，且隨著病變級(jí)別增加而增加，提示HPV多重感染與宮頸癌變的發(fā)生密切相關(guān)，結(jié)果與文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道一致，但與張?jiān)萚10]報(bào)道相反。HPV感染率最高在宮頸鱗癌中的高危型感染，且高危型HPV感染隨著病變級(jí)別增加而增加，說(shuō)明持續(xù)高危型HPV感染在宮頸癌變過(guò)程中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，提示HPV多重感染患者出現(xiàn)持續(xù)高危型HPV感染與的危險(xiǎn)性更大，更容易導(dǎo)致宮頸癌變。

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Relationship between different types of HPV multiple infection and cervical lesions*

WENLu-sheng1,MENGJia-rong1,TANGZhong-hui2△,HUANGZhong-qing2,GUOYi-he1,PANXian-xin1

(1.DepartmentofPathology,175thHospitalofPLA/AffiliatedSoutheastHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China;2.FacultyofBasicMedicine,ZhangzhouHealthVocationalCollege,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To explore the relationship between different types of human papilomavirus(HPV) multiple infection and cervical lesions.Methods The gene chip technology was applied to detect 24 types of HPV genotypes in the paraffin tissue specimens from 200 patients with cervical lesions,the histopathological diagnosis was used as the gold standard of cervical lesion diagnosis.Results In 200 specimens,the total infection rate of HPV was 51.50%(103/200),in which the HPV infection rates in chronic cervictis,low-CIN1,high-CIN3 and squamous cell carcinoma were 22/57(38.60%),12/33(36.36%),44/81(54.32%) and 25/29(86.21%),respectively,and were correlated with the cervical lesions(P<0.01);In different cervical lesions,single HPV infection was significantly higher than multiple HPV infection(P<0.05);The HPV infection rate in the high-risk type single HPV infection group had no correlated with the cervical lesions(P>0.05).The HPV infection rates in the multiple infection,high-risk HPV infection,high-risk HPV multiple infection,low-risk HPV multiple infection,and high and low risk mixed HPV infection groups had statistically significant differences among different grades of cervical lesions(P<0.05).Conclusion The infection rate of HPV is correlated with the different degrees of cervical lesion.The persistent high-risk HPV infection and multiple HPV infection are the important factors for aggravating the cervical lesions.

human papilomavirus; multiple; cervical lesions

福建省漳州市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZZ2012J21)；中國(guó)人民解放軍第一七五醫(yī)院(廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院)青年苗圃基金項(xiàng)目(12Y014)。

溫路生，男，主治醫(yī)師，本科，主要從事婦科疾病與腫瘤的預(yù)防及早期診斷方面的研究?！?/p>

，E-mail：tzh6409@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.007

A

1672-9455(2015)15-2156-02

2015-02-22

2015-05-18)