張海霞，馮若飛,，王 丹，徐 雷，謝晶瑩，李向茸，馬忠仁△

(1.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，蘭州 730030)

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·論 著·

人腦心肌炎病毒免疫球蛋白M捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗的建立及初步應(yīng)用

張海霞1，馮若飛1,2，王 丹2，徐 雷2，謝晶瑩2，李向茸1，馬忠仁1△

(1.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，蘭州 730030)

目的 建立腦心肌炎病毒(EMCV) 免疫球蛋白M(IgM)捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法，用于感染EMCV血清學(xué)早期診斷。方法 用抗人IgM(μ鏈)單抗進行包被，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的EMCV為酶標(biāo)抗原，初步建立EMCV IgM捕獲ELISA；對建立的方法進行條件優(yōu)化及特異性、精密性、穩(wěn)定性等驗證。結(jié)果 建立的EMCV IgM捕獲ELISA檢測方法抗體包被濃度為1 μg/mL，EMCV-HRP工作濃度和反應(yīng)時間分別為1∶400和45 min，封閉液為10%馬血清時該法檢測效果可達最佳，3批試劑批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于5%，且特異性、精密性及穩(wěn)定性較好。結(jié)論 建立的EMCV IgM捕獲ELISA法特異、精密且穩(wěn)定，可用于人感染EMCV的早期檢查，為EMCV的診斷奠定基礎(chǔ)。

腦心肌炎病毒； 免疫球蛋白M； 酶聯(lián)免疫吸附試驗； 初步應(yīng)用

腦心肌炎病毒(EMCV)是微RNA病毒科，心病毒屬的唯一成員，根據(jù)分離來源的不同，有時也稱哥倫比亞-SK(Columbia-SK)、小鼠腦脊髓炎病毒(MEV)、門哥(Mengo)病毒[1-2]。1945年在美國佛羅里達州，從一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內(nèi)，首次分離到EMCV，1958年在巴拿馬首次證明導(dǎo)致豬死亡的病原體是EMCV[3-7]。隨后陸續(xù)有報道，EMCV在世界上很多國家爆發(fā)和流行[8-9]。EMCV和其他部分小RNA病毒有著類似的組裝結(jié)構(gòu)和抗逆的理化特性，病毒粒子呈圓形狀，直徑為20～30 nm，無囊膜裸露的核衣殼，病毒粒子的衣殼為對稱結(jié)構(gòu)的二十面體，衣殼內(nèi)含一單股正鏈RNA，3′端有poly(A)尾，5′端沒有帽子結(jié)構(gòu)，該衣殼在CsCl中的浮密度為1.33～1.34 g/cm3。本病毒在56 ℃ 1 h能滅活，但對氯仿、乙醚、乙醇等脂溶劑有很強的抵抗力。哺乳動物中以豬對EMCV的敏感性最強，感染后多出現(xiàn)致死性心肌炎和心肌周圍炎等，處于妊娠期的母豬大多出現(xiàn)死胎、弱胎、流產(chǎn)、木乃伊胎等繁殖性障礙，其他的表象中，健康豬多呈隱性感染[10-13]。據(jù)有關(guān)報道，豬腦心肌炎發(fā)病高的地區(qū)，人感染EMCV也較高[14]。靈長類動物中主要以人類為主，人類被EMCV感染后，大多出現(xiàn)頭痛、發(fā)熱、精神萎靡、身體僵硬、嘔吐等主要癥狀，有學(xué)者從患者和其他正常人群血清中檢測到 EMCV抗體，并從患腦膜炎和腦炎的兒童體內(nèi)分離到EMCV，說明EMCV可感染人類并可造成較為嚴重的損傷，這就要求在臨床中務(wù)必做到早診斷、早預(yù)防[15]。然而，現(xiàn)有針對EMCV IgM的檢測只有中和試驗等一些傳統(tǒng)方法，不僅耗時、費用高，而且結(jié)果準確度不高，難以滿足現(xiàn)代快速、準確、成本低的診斷要求。因此，建立一種快速準確檢測EMCV IgM抗體的方法在EMCV早期診斷中尤為重要。利用抗人μ鏈抗體捕獲EMCV IgM，可以達到早期血清學(xué)檢測、免疫分析、抗原抗體相互作用檢測等各種試驗?zāi)康模瑸镋MCV的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 EMCV(VR-129株，ATCC)抗原由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室提供。

1.2 試劑 抗人IgM(μ鏈)單抗購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)購自華美生物工程公司；

1.3 EMCV標(biāo)酶 通過改良過碘酸法，將HRP標(biāo)記于滅活的EMCV，之后將標(biāo)記混合物經(jīng)硫酸銨鹽析，NaAC-HAC中透析，柱層析(Sepharose-4FF)，收集峰1，即為酶標(biāo)記抗原(EMCV-HRP)，經(jīng)間接ELISA測定效價后，加入50%的丙三醇，分裝置于-20 ℃凍存[16-17]。

1.4 人EMCV IgM捕獲ELISA的建立及條件優(yōu)化

1.4.2 陰陽性對照的確定 參考上述初步建立的EMCV IgM捕獲ELISA操作步驟，篩選出EMCV IgM陽性血清，陰性血清；選取A值最高的陽性3份混合，選取A值最低陰性的3份混合，并56 ℃滅活30 min后分別用0.22 μm的膜過濾，無菌分裝，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 條件優(yōu)化 (1)最佳包被濃度的確定。將抗人IgM(μ鏈)單抗分別稀釋至8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL進行包被，其余步驟參照1.4.1，根據(jù)結(jié)果確定最佳的包被濃度。(2)最佳EMCV-HRP濃度的確定。EMCV-HRP的工作濃度分別為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600，其余步驟參照1.4.1，根據(jù)結(jié)果確定最佳的EMCV-HRP濃度。(3)最佳酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間的確定。加入的酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間分別為15、30、45、60、75 min，其余步驟參照1.4.1，根據(jù)結(jié)果確定最佳酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間。(4)最佳底物顯色的時間。加入底物顯色時間分別為10、15、20、25、30、35 min，其余步驟參照1.4.1，根據(jù)結(jié)果確定最佳底物顯色時間。(5)最佳封閉液的選擇。封閉液分別選用PBST、10%馬血清、10%牛血清、1%卵清蛋白、2%蛋白胨、5%脫脂奶粉，其余步驟參照1.4.1，根據(jù)結(jié)果確定最佳封閉液。

1.5 精密性試驗 選擇1份A450 nm/A630 nm值在1.1左右的陽性對照血清進行精密性驗證。抽取同一批試劑的5塊包被板，每板抽取1條，每條抽取2孔共10孔，進行批內(nèi)精密性試驗；抽取連續(xù)3批試劑按批內(nèi)精密性試驗抽樣，共30孔，進行批間精密性試驗，計算變異系數(shù)(CV)，分析批內(nèi)和批間精密性。

1.6 特異性試驗 用上述方法分別檢測乙型肝炎病毒(HBV)、戊型肝炎病毒(HEV)抗體、乙型腦炎病毒(JEV) IgM抗體及陰陽性對照，其余步驟參照1.4.1，確定該方法的特異性。

1.7 穩(wěn)定性試驗 將上述包被板及試劑隨機分成兩部分，分別置4、37 ℃各保存6 d，分別檢測7個弱陽性樣本(A值在0.2左右樣本)，其余步驟參照1.4.1，驗證試劑的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 EMCV IgM捕獲ELISA方法的最佳條件 最佳條件確定均以陽性血清A值作為P值，陰性對照A值作為N值，分別計算P/N。然后以考察條件作橫坐標(biāo)，P/N作縱坐標(biāo)繪制折線圖。

2.1.1 最佳包被濃度 隨著包被濃度增加，P/N先升高后下降，在0.5～1 μg達到峰值，一般選擇最優(yōu)條件為峰值左右，且稀釋度不宜過大，所以最佳的抗人IgM包被濃度為1 μg/mL。見圖1。

圖1 抗人IgM包被濃度的確定結(jié)果(P/N)

2.1.2 最佳EMCV-HRP工作濃度 每個IgM陽性血清稀釋度條件下，P/N值都隨著EMCV-HRP稀釋的增加而先升高后下降，而在1∶400濃度時的P/N均最大，所以EMCV-HRP的最佳工作濃度為1∶400。見圖2。

圖2 酶標(biāo)EMCV工作濃度(P/N)

2.1.3 最佳EMCV-HRP反應(yīng)時間 隨著EMCV-HRP反應(yīng)時間的增加，P/N先升高后下降，而在反應(yīng)時間為45 min時，P/N最高，所以EMCV-HRP的最佳反應(yīng)時間為45 min。見圖3。

圖3 酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間確定結(jié)果(P/N)

2.1.4 最佳底物顯色時間 隨著顯色液反應(yīng)時間的增加，P/N先升高后下降，在顯色時間為25 min時，P/N最高，所以顯色液的最佳反應(yīng)時間為25 min。見圖4。

圖4 最佳顯色反應(yīng)時間確定結(jié)果(P/N)

2.1.5 最佳封閉液的確定 在不同封閉液下，10%馬血清封閉時，P/N最大，因此10%馬血清封閉液為最適。見圖5。

圖5 封閉液確定(P/N)

2.2 精密性試驗 3批試劑的批內(nèi)及批間CV均小于5%，表明建立的方法精密性較好。見表1。

表1 方法的精密性驗證

2.3 特異性試驗 本方法只能檢出EMCV IgM抗體，其他均為陰性，表明該法特異性較好。見圖6。

圖6 特異性驗證

圖7 熱加速穩(wěn)定性

2.4 穩(wěn)定性試驗 熱加速降解實驗試劑與4 ℃存放6 d的試劑相比，檢測的7個弱陽性樣本，存放于37 ℃的檢測值略低于4 ℃，但變化相差不大，表明穩(wěn)定性良好。見圖7。

3 討 論

本研究成功建立了EMCV IgM捕獲ELISA方法：將抗人IgM(μ鏈)單抗稀釋至1 μg/mL，以100微升/孔加入96孔聚苯乙烯微量滴定板，4 ℃過夜；PBST洗滌1次，并輕輕拍干，用10%馬血清封閉液室溫封閉過夜；甩干后，加入100微升/孔待檢樣本，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗滌5次拍干后，加入100微升/孔 1∶400的EMCV-HRP，37 ℃反應(yīng)45 min，洗滌5次后拍干，加入底物顯色25 min，終止，讀取450和630 nm波長處樣本A值。

對上述優(yōu)化的EMCV IgM捕獲ELISA方法進行驗證，結(jié)果顯示：批內(nèi)及批間CV均小于5%，精密性良好；只能特異性地檢出EMCV IgM抗體；包被板和試劑具有良好的熱穩(wěn)定性。說明該EMCV IgM捕獲ELISA方法的精密性、特異性及穩(wěn)定性均較好。

IgM是人的免疫球蛋白之一，在感染過程中IgM首先出現(xiàn)，但持續(xù)時間不長，是近期感染的標(biāo)志。本研究首次成功建立的EMCV IgM捕獲ELISA法，較其他ELISA而言，檢測樣本時不需要稀釋，且不受類風(fēng)濕因子的影響，有很高的特異性，不產(chǎn)生假陽性，其準確性較高。且較間接ELISA及雙抗原夾心ELISA，該法更能準確地應(yīng)用于EMCV感染早期的快速診斷，從而確定EMCV早期感染情況?？傊摲镋MCV早期感染的檢測提供了新的手段，也為EMCV抗體監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查提供了更有效的工具。

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Establishment and preliminary application of EMCV IgM capture ELISA method*

ZHANGHai-xia1,FENGRuo-fei1,2,WANGDan2,XULei2,XIEJing-ying2,LIXiang-rong1,MAZhong-ren1△

(1.GansuEngineeringResearchCenterforAnimalCells,Lanzhou,Gansu730030,China;2.KeyBio-EngineeringandTechnologyLaboratoryofNorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu730030,China)

Objective To establish the encephalomyocarditis virus(EMCV) immunoglobulin M(IgM) captured enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) detection method for the application in early serological diagnosis of EMCV infection.Methods Anti-human(μ chain) monoclonal antibody was used to conduct the coating and the horse radish peroxidase(HRP) labelled EMCV served as the enzyme labeled antigen,the EMCV IgM capture ELISA method was preliminarily established;The established method was performed the conditional optimization and verification of the specificity,precision and stability.Results The antibody coating concentration in the established EMCV IgM captured ELISA method was 1 μg/mL,the EMCV-HRP work concentration and reaction times were 1∶400 and 45 min respectively.When the blocking solution was 10% horse serum,this method achieved the best effect.The intra-assay and inter-assay coefficients of variation in 3 batches of reagents were less than 5%,and the specificity,precision and stability were better.Conclusion The established EMCV IgM capture ELISA method is specific,precise and stable,can be used for the detection of early human EMCV infection and lays the foundation for the EMCV diagnosis.

EMCV; IgM; ELISA; preliminary application

國家自然科學(xué)基金項目(31160033、31460665)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT13091)。

張海霞，女，助教，碩士，主要從事分子病毒學(xué)方面的研究?！?/p>

，E-mail:mazhongren@xbmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.001

A

1672-9455(2015)15-2139-03

2015-02-25

2015-03-15)