李艷君,李妍妮,錢揚(yáng)會,丁賠賠,丁毅偉,趙強(qiáng)元

(海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100048)

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·論 著·

應(yīng)用多位點(diǎn)VNTR分析進(jìn)行銅綠假單胞菌院內(nèi)感染溯源的研究*

李艷君,李妍妮,錢揚(yáng)會,丁賠賠,丁毅偉,趙強(qiáng)元△

(海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100048)

目的 應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)分析方法進(jìn)行多重耐藥銅綠假單胞菌分子分型，為由銅綠假單胞菌引發(fā)的院內(nèi)感染的溯源和流行病學(xué)調(diào)研提供依據(jù)。方法 從銅綠假單胞菌基因組中篩選12個(gè)VNTR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成引物；對98株多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物毛細(xì)管電泳；根據(jù)產(chǎn)物大小計(jì)算各VNTR位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 12個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)(DI)為0.45～0.88，將98株銅綠假單胞菌分成5個(gè)群，88個(gè)基因型，同病區(qū)分離的菌株具有一定的同源性。結(jié)論 多位點(diǎn)VNTR分析具有很高的分辨率，適用于銅綠假單胞菌基因分型和溯源研究，具有很好的應(yīng)用前景。

銅綠假單胞菌； VNTR； 基因分型； 同源性

隨著抗生素的廣泛使用和各種侵入性治療技術(shù)的開展，院內(nèi)感染發(fā)生率居高不下，給臨床治療帶來了很大困難，同時(shí)給醫(yī)療機(jī)構(gòu)和患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染最主要的病原菌之一[1]，可引起多部位、多系統(tǒng)的感染，銅綠假單胞菌肺炎致死率達(dá)30%以上，敗血癥的病死率則高達(dá)80%～90%。近年來，銅綠假單胞菌耐藥形勢日趨嚴(yán)峻，多重耐藥及泛耐藥株的分離率呈逐年上升趨勢[2-3]。因此，早期診斷并控制由銅綠假單胞菌引起的院內(nèi)感染，是提高治愈率，減少病死率的關(guān)鍵。

衛(wèi)生部《三級綜合醫(yī)院評審標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則(2011)》中要求按照《醫(yī)院感染監(jiān)測規(guī)范》，監(jiān)測重點(diǎn)環(huán)節(jié)、重點(diǎn)人群與高危險(xiǎn)因素，采用監(jiān)控指標(biāo)管理，控制并降低醫(yī)院感染風(fēng)險(xiǎn)。病原菌的溯源是院內(nèi)感染監(jiān)控的主要手段，能夠?yàn)樵簝?nèi)獲得性感染的診斷提供流行病學(xué)依據(jù)。

然而目前對于銅綠假單胞菌引起的各類感染是否為院內(nèi)獲得性感染，其感染源自何處，其傳播途徑如何都缺乏直觀、可靠的判斷依據(jù)，建立一種簡單、快速、可靠、普遍適用的分型方法已迫在眉睫，對醫(yī)院感染的流行病學(xué)研究也有十分重要的意義。本研究應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)分析方法，對收集的多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行分型和溯源的初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 98株多重耐藥銅綠假單胞菌包括分離自2012～2014年本院22個(gè)病區(qū)的89株，北京醫(yī)院7株，廣安門醫(yī)院1株和1株標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，所有菌株分離培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行增菌，應(yīng)用離心柱法提取菌株DNA。

1.2 儀器與試劑 主要儀器包括BC-subMIDI電泳儀(北京六一儀器廠)；BioSens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；GeneAmp 9600 PCR儀(ABI公司)；3730XL DNA分析儀(ABI公司)。主要試劑包括TAKARA Taq HotStart擴(kuò)增試劑(TAKARA公司)，高純度甲酰胺，3100POP-4膠，ROX-500 和ROX-1000 內(nèi)標(biāo)(北京閱微基因技術(shù)有限公司)，毛細(xì)管電泳緩沖液(美國ABI 公司)。

1.3 方法 用12對VNTR 擴(kuò)增引物對菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用 15 μL擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min后，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸5 min。1.0 μL產(chǎn)物加入相對分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL，95 ℃變性3 min后上機(jī)檢測。

1.4 同源性分析 采用Genescan3.7計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，計(jì)算出每株菌株在每個(gè)位點(diǎn)的VNTR 重復(fù)數(shù)。將 VNTR 重復(fù)數(shù)結(jié)果導(dǎo)入BioNumerics 6.00 軟件，選擇分類數(shù)據(jù)類型，使用UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析銅綠假單胞菌各VNTR基因型分布特征和聚類關(guān)系，進(jìn)行菌株同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 銅綠假單胞菌基因組中的12個(gè)VNTR位點(diǎn)及特征 研究所選的12個(gè)VNTR位點(diǎn)特征及其多態(tài)性指數(shù)(DI)，見表1。

2.2 基于12個(gè)VNTR位點(diǎn)的銅綠假單胞菌基因分型 應(yīng)用12個(gè)VNTR位點(diǎn)將98株多重耐藥銅綠假單胞菌分成5個(gè)群，88個(gè)基因型，見圖1。其中外院8株菌株和ATCC27853分布在E群，本院高壓氧病區(qū)的12株菌(編號為GYY-1～12)分布在D群，ICU病區(qū)的12株菌(編號為ICU-1～12)分布在C群，心臟中心病區(qū)(編號為XZ-1～4)和干部綜合內(nèi)科(編號為GZ-1～2)的菌株分布在B群，呼吸內(nèi)科病區(qū)的菌株(編號為HX-1～8)分布在A群，其他病區(qū)的菌株零散分布在5個(gè)群中。

2.3 部分菌株的同源性分析結(jié)果 研究中選擇的8例患者的不同分離株，包括同一類型標(biāo)本分離時(shí)間不同，同一患者不同類型標(biāo)本來源的12個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)據(jù)，見表2。除患者GX-1在2012年和2013年分離自痰標(biāo)本的2株銅綠假單胞菌在ms216和ms172位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)有所不同，其他同一患者的不同分離株在12個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)均相同。

表2 來源于8例患者的不同分離株在12個(gè)VNTR位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)

圖1 基于12個(gè)VNTR位點(diǎn)的98株銅綠假

3 討 論

銅綠假單胞菌是引發(fā)院內(nèi)感染最主要的病原菌，隨著多重耐藥和泛耐藥株的不斷出現(xiàn)，給臨床治療帶來很大的困難，進(jìn)行分子分型和同源性分析，對于判斷感染來源，切斷傳播途徑，控制感染蔓延具有非常重要的流行病學(xué)意義。而目前對于銅綠假單胞菌的分型和溯源研究還很局限，有研究采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、重復(fù)片段PCR(rep-PCR)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)等方法對銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性分析[4-7]，RAPD雖然分辨力高，但是可重復(fù)性較差，而且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，需要用到同位素；rep-PCR操作相對簡單，但是分辨力不夠，很難區(qū)分近緣菌株，而且數(shù)據(jù)分析對軟件要求較高，很難在普通實(shí)驗(yàn)室普及。

VNTR是真核及原核生物基因組中廣泛存在的一種重復(fù)序列，相同的序列以首尾相連的形式串聯(lián)在一起，在不同個(gè)體間由于重復(fù)次數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)區(qū)分。近年來，VNTR作為一種高分辨力的分型溯源方法應(yīng)用日益廣泛，目前已經(jīng)用于對鼠疫耶爾森菌、流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌和嗜肺軍團(tuán)菌等進(jìn)行基因分型和基因組多態(tài)性研究[8-10]。

近年來，國外已有報(bào)道應(yīng)用VNTR對銅綠假單胞菌進(jìn)行基因分型的研究[11-13]，本研究在此基礎(chǔ)上，對本院及外院98株多重耐藥的銅綠假單胞菌進(jìn)行分型和同源性分析。本研究中所選用的VNTR位點(diǎn)，其中11個(gè)為前期研究選用的成熟位點(diǎn)[11]，pa5970為本研究通過生物信息學(xué)手段，從20株完成全基因組測序的銅綠假單胞菌基因組中篩選的新位點(diǎn)。DI是評價(jià)VNTR分型能力的指標(biāo)，DI值過低，分型能力不足，難以將近源菌株進(jìn)行區(qū)分，DI值過高，容易導(dǎo)致非同源相似性。本研究選擇的12個(gè)位點(diǎn)，DI分布適中，在0.48～0.89之間，一方面具有一定的分型能力，另一方面可避免高突變導(dǎo)致的非同源相似性。

多位點(diǎn)VNTR分析方法具有很高的分辨率，本研究中12個(gè)位點(diǎn)將98株銅綠假單胞菌分成5個(gè)群(A～E)，88個(gè)基因型(圖1)。除同一患者不同分離株具備同一基因型外，其他菌株各成一型，說明多位點(diǎn)VNTR分析的分型能力非常強(qiáng)大。從圖1可見，本院多重耐藥銅綠假單胞菌主要分布在高壓氧病區(qū)(GYY)為主的D群、ICU為主的C群、心臟中心病區(qū)(XZ)和干部綜合內(nèi)科病區(qū)(GZ)為主的B群和呼吸科病區(qū)(HX)為主的A群，其他病區(qū)的菌株呈現(xiàn)散在分布，分析可能是由于這些患者在不同病區(qū)間進(jìn)行過治療，攜帶的菌株不具有科室特異性。另外，本研究中選用的8株外院菌株和ATCC27853自成一群(A群)，與本院各科室的菌株實(shí)現(xiàn)了很好的區(qū)分，說明基于12個(gè)VNTR位點(diǎn)的分型能夠區(qū)分和判斷外來的感染。

本研究對基于VNTR的同源性分析也進(jìn)行了初步探討，選擇了8例患者的不同分離株進(jìn)行VNTR分析(見表2)。結(jié)果除了來自干部病房心血管內(nèi)科(GX)的患者在2012年和2013年分別分離的2株菌在ms216和ms172位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)有所不同以外，其他7例患者的不同分離株在12個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)完全一致，由此可以判斷患者感染的原發(fā)灶。例如患者GZ-1，2013年10月首先在痰中分離出銅綠假單胞菌，同月在咽拭子標(biāo)本中分離出第2株分離株，11月從血培養(yǎng)標(biāo)本中分離出第3株分離株，12月患者發(fā)生尿路感染，培養(yǎng)分離出第4株銅綠假單胞菌，2014年1月又從患者痰液標(biāo)本分離出第5株分離株，經(jīng)VNTR分析，這5株不同時(shí)間、不同來源的銅綠假單胞菌為同一克隆株，推測患者首先通過呼吸道感染，后來入血，又導(dǎo)致了尿路感染，呼吸道可疑為原發(fā)灶。

本研究通過應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選銅綠假單胞菌基因組中的VNTR位點(diǎn)，探討其分布及其特征，對保存的多重耐藥菌株進(jìn)行基因分型研究，摸索實(shí)驗(yàn)方法和條件，初步建立了基于多位點(diǎn)VNTR分析的同源性檢測技術(shù)方法，積累部分病區(qū)的多樣性數(shù)據(jù)資源，為銅綠假單胞菌引起的院內(nèi)感染和溯源流行病學(xué)監(jiān)控提供了技術(shù)方法和診斷依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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Study of traceability of nosocomial infection of Pseudomonas aeruginosa by multi-loci VNTR*

LIYan-jun,LIYan-ni,QIANYang-hui,DINGPei-pei,DINGYi-wei,ZHAOQiang-yuan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NavyGeneralHospital,Beijing100048,China)

Objective To conduct the molecular typing of multi-drug-resistance Pseudomonas aeruginosa by using the multi-loci VNTR analysis to provide the basis for the traceability the nosocomial infection caused by Pseudomonas aeruginosa and epidemiological survey and research.Methods 12 VNTR loci were screened from the Pseudomonas aeruginosa genome and the PCR primers were designed.98 strains of multi-drug-resistance Pseudomonas aeruginosa were perfromed the PCR amplification by using the above primers and the products were conducted the capillary electrophoresis.The repeat numbers of various loci were calculated according to the products size and the phylogenetic tree was constructed for conducting the data analysis.Results The diversity index(DI) of 12 loci ranged from 0.45-0.88,and 98 strains of Pseudomonas aeruginosa were grouped into 5 clusters,88 genotypes.The isolates from the same ward presented certain homology.Conclusion The multi-loci VNTR analysis presents higher discrimination power and suitable for genotyping and traceability research of Pseudomonas aeruginosa,and has good application prospect.

Pseudomonas aeruginosa; VNTR; genotype; homology

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170008)。

李艷君，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事醫(yī)學(xué)微生物研究。

△通訊作者，E-mail：zhaoqiangyuan001@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.001

A

1672-9455(2015)19-2811-03

2015-03-05

2015-06-10)