孟 峻,侯艷軍,唐 韜,張永梅,劉 珊,劉 洋,呼格吉樂

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050)

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·論 著·

小鼠14-3-3ε蛋白基因的克隆及其真核表達載體的構建*

孟 峻,侯艷軍,唐 韜,張永梅,劉 珊,劉 洋,呼格吉樂

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050)

目的 構建小鼠14-3-3ε真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε，并觀察其在真核細胞中的表達。方法 通過反轉錄-聚合酶鏈反應從小鼠肝組織中獲得編碼14-3-3ε的cDNA,定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1-ZEO(+)中，經酶切和測序鑒定正確后，應用脂質體轉染HEK293細胞，并通過蛋白免疫印跡檢測細胞內14-3-3ε的表達。結果 構建了真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε，將其轉染HEK293細胞48 h后，蛋白免疫印跡檢測到細胞內14-3-3ε的表達。結論 成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε，為研究14-3-3ε在小鼠卵母細胞和小鼠-細胞受精卵G2/M轉換中作用的研究奠定了基礎。

14-3-3ε蛋白； HEK293細胞； 真核表達載體

14-3-3蛋白家族是一組高度保守的可溶性酸性蛋白質，相對分子質量為(28～33)×103，廣泛分布于各種真核細胞中[1]。14-3-3蛋白不僅是一種存在于腦組織中的蛋白，而且也廣泛存在于其他各種組織中。14-3-3蛋白高度保守,在哺乳動物發(fā)現(xiàn)7個家族成員,分別為β、γ、ε、σ、ζ、τ和η，并且有7個不同的基因編碼，果蠅、酵母只有兩種基因編碼，植物有13種基因編碼14-3-3蛋白[2]。14-3-3作為一個二聚體蛋白家族，調控蛋白質之間的相互作用，廣泛參與細胞信號轉導、周期進程、生長增殖、分化凋亡和擴展遷移。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株、菌種和質粒:克隆載體pGEM-T vector為Promega公司產品；真核表達載體pcDNA3.1-ZEO為Invitrogen公司產品；E.coli DH5α感受態(tài)菌株、HEK293細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產品)；TRIZOL試劑、LipofectamineTM2000為美國Invitrogen公司產品；限制性核酸內切酶(XhoI、BamHI、XbaI、EcoRI)及Pfu DNA Polymerase為MBI公司產品；質粒DNA小提取試劑盒(上海生工生物有限公司產品)；DNA凝膠回收試劑盒(大連寶生物公司產品；T4 DNA連接酶為New England Biolab公司產品；鼠抗兔14-3-3ε單克隆抗體(Abcam)、β-Actin抗體(Santa Cruz)、兔來源HA標簽單克隆抗體為Sigma公司產品。聚合酶鏈反應(PCR)擴增引物的合成由Invitrogen 公司完成，DNA測序均由上海生工公司完成?；驍U增儀(Biometra，德國)；低溫超速離心機(Sigma，美國)；臺式高速離心機(TG16-WS，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；電泳儀、電泳槽0.75ram垂直板(美國Bio-tad公司)；凝膠自動成像儀GDS8000(BIO-RAD，美國)；紫外分光光度儀(PYE-UNICAM SPECTRONIC公司，美國)；細菌培養(yǎng)箱、空氣浴振蕩器(上海艾測電子科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱CBll5(WTB-binder，德國)。

1.3 方法

1.3.1 引物設計 為了構建HA標簽的14-3-3ε表達載體，在編碼14-3-3ε cDNA起始密碼上游加上HA的編碼序列，F(xiàn)orward primer:5′-ATG TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT GAT GAT CGG GAG GAT CT-3′,reverse primer:5′-GCT TTT ATT TCG TCT CAC TGA TTC TCA TCT T-3′。

1.3.2 提取總RNA 將小鼠頸椎脫位處死,剪開腹部,取其肝組織約30 mg。將30 mg肝組織移入2 mL直筒離心管中，加入Trizol 1 mL，剪碎肝組織，電動勻漿，勻漿后4 ℃ 12 000 g 離心1 min去除不溶物。取上清液，移入1.5 mL EP管中，液體量約為1 mL，加入0.2 mL氯仿，劇烈振搖15 s，室溫靜置2 min。4 ℃ 12 000 g離心15 min，吸取上層水相至另一新EP管中，加入異丙醇0.5 mL，室溫靜置10 min，4 ℃ 10 000 g離心10 min，離心后管底見明顯白色膠樣沉淀，棄上清液，加入75%乙醇1 mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃ 7 500 g離心5 min，盡量棄上清液。室溫晾干15 min(直至沒有明顯乙醇液體)，加50 μL DEPC H2O溶解RNA樣品，用吸管反復吹打溶解RNA，測A值定量RNA濃度。

1.3.3 反轉錄PCR(RT-PCR)合成目的cDNA片段 反應體系為50 μL:2×反應混合物25 μL、模板RNA 10 μL、正向/反向引物(10 μmol/L)各1 μL、反轉錄Taq Mix 1 μL、去RNA酶水12 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,反應35 個循環(huán),72 ℃延伸5 min。

1.3.4 PCR產物的回收和純化 瓊脂糖電泳檢測PCR產物大小，在紫外燈下切出瓊脂糖膠塊中的目的DNA，切碎膠塊后,加入適量Binding Buffer Ⅱ，55 ℃水浴將膠塊完全熔化，然后移入UNIQ10柱中，8 000 r/min離心1 min，棄濾液。加入Wash Solution，離心1 min，棄濾液，將柱子放入同一收集管中，重復此過程。12 000 r/min再次離心15 s，在UNIQ10柱子上加入適量的提前65 ℃預熱的Elution Buffer，室溫靜置、離心，離心管中液體即為含有HA-14-3-3ε的cDNA片段。取少量樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測回收質量，并測定A260/A280。

1.3.5 目的基因與T載體的連接及其鑒定 純化的PCR產物與pGEM-T載體連接，反應體系為10 μL，HA-14-3-3ε的cDNA 2 μL、2×快速連接緩沖5 μL、T載體1 μL、T4 DNA連接酶1 μL、去RNA酶水1 μL。16 ℃反應過夜，將連接后的載體轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，在LB培養(yǎng)基中增菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)l h后，涂布于Amp+瓊脂平板培養(yǎng)基中，37 ℃過夜。挑取單菌落于Amp+LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，測其A值約2～3時用質粒提取試劑盒提取質粒。

1.3.6 用質粒提取試劑盒提取質粒 細菌培養(yǎng)液1.5～5.0 mL,12 000 r/min離心2 min,倒掉或吸干培養(yǎng)基,在菌體沉淀中加入250 μL SolutionⅠ,吸打或振蕩至徹底懸浮菌體。加入250 μL SolutionⅡ，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻，室溫靜置2～4 min，加入350 μL SolutionⅢ，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻，12 000 r/min離心10 min，將上清液全部小心移入吸附柱，8 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的液體，在吸附柱中加入500 μL Wash Solution,10 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的液體，再用500 μL Wash Solution洗一次，10 000 r/min離心1 min,空吸附柱，12 000 r/min離心2 min，將吸附柱放入干凈的1.5 mL離心管中,在吸附膜中央加入50～100 μL Elution buffer,室溫靜置2 min,10 000 r/min離心1 min,將所得質粒DNA溶液置于-20 ℃保存。

1.3.7 質粒的酶切鑒定 質粒用限制性內切酶EcoRI單酶切,酶切反應體系如下:10×緩沖液1 μL、pGEM-T/HA-14-3-3ε 1 μL、EcoRI 0.5 μL、雙蒸水7.5 μL、總體積10 μL。37 ℃ 90 min,瓊脂糖電泳(膠的濃度為1.5%)檢測酶切條帶,選擇酶切條帶片段大小與預期相符合的陽性克隆保存，然后進行DNA測序分析。

1.3.8 表達載體的構建及鑒定 經測序鑒定正確的陽性克隆與pcDNA3.1-ZEO(+)載體用EcoRI單酶切后進行連接反應,酶切反應體系為20 μL:pGEM-T/HA-14-3-3ε(或pcDNA3.1-ZEO(+)2 μL、10×緩沖液2 μL、EcoRI 1 L、雙蒸水15 L。37 ℃過夜,消化完的pcDNA3.1-ZEO(+)加 1 μL CIP,37 ℃水浴60 min去磷酸基,然后進行瓊脂糖凝膠電泳(膠的濃度為1.5%)，分別從分離膠中回收HA-14-3-3ε片段、pcDNA3.1-ZEO(+)載體,分別測定回收片段相應的濃度。連接反應的反應體系為20 μL(HA-14-3-3ε cDNA 與pcDNA3.1-ZEO(+)按摩爾比3∶1混合：10×T4連接酶緩沖液2 μL、目的產物、pcDNA3.1-ZEO(+)、T4 DNA連接酶 1 μL。16 ℃反應過夜，將反應的連接產物轉化到感受態(tài)大腸桿菌，挑選單菌落進行培養(yǎng)，用質粒提取試劑盒提取質粒。質粒用EcoRI單酶切鑒定,選擇酶切條帶片段大小與預期相符合的陽性克隆保存，進一步行質粒DNA序列測定分析，構建成pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε表達載體。

1.3.9 細胞培養(yǎng)和轉染 HEK293細胞用DMEM培養(yǎng)液(添加10%胎牛血清,100 U/mL青霉素，10 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)。用LipofectamineTM2000 按說明書進行轉染HEK293細胞。將HEK293細胞分散于100 mm的培養(yǎng)皿(2×106細胞/皿,10 mL含10% FBS培養(yǎng)液/皿)。在24 h后，細胞共轉染5 μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε DNA。

1.3.10 蛋白免疫印跡檢測14-3-3ε的表達 轉染細胞48 h 后離心去除培養(yǎng)液，加入SDS樣品緩沖液，裂解細胞提取總蛋白,用BCA 蛋白定量試劑盒定量，進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉膜,5%脫脂奶粉封閉，分別用一抗(鼠抗兔HA標簽抗體,鼠抗羊β-Actin單克隆抗體)及羊抗鼠二抗進行孵育,洗膜后，ECL化學發(fā)光法顯影成像。

2 結 果

2.1 小鼠14-3-3εcDNA的克隆及鑒定 提取小鼠肝組織細胞總RNA,瓊脂糖電泳檢測總RNA的提取情況。用RT-PCR反轉錄出14-3-3εcDNA,PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(膠的濃度為1.5%),14-3-3εcDNA片段大小為809 bp，結果在大約800 bp的位置可見特異性目的條帶(圖1),與預期結果完全一致。

注：1為RT-PCR產物；Marker為DNAmarkerDL10 kb。

圖1 RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε的構建及鑒定 HA-14-3-3ε片段與T連接，陽性克隆經測序鑒定基因插入正確。挑選鑒定正確的克隆pGEM-T/HA-14-3-3ε和pcDNA3.1-ZEO(+)載體均以EcoRⅠ單酶切后連接，連接產物經限制性內切酶EcoRⅠ酶切鑒定，結果見圖2。電泳結果顯示800 bp相應的目的條帶和5 000 bp的載體條帶，與預期片段大小相符，經測序進一步證明插入基因正確，獲得pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε載體，用于體外轉錄。

注：1為pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε質粒DNA的單酶切產物；Marker為DNAmarkerDL15 kb。

圖2 pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε質粒DNA的單酶切結果

2.3 真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε在KEK293細胞中的表達 通過脂質體介導的基因轉染方法將構建的載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε轉染Hek293細胞,用anti-β-Actin抗體和anti-HA標簽抗體進行Western blotting檢測，結果顯示，在轉染了真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε的Hek293細胞內，HA-14-3-3ε有表達(圖3)。提示真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε已成功構建并能正確表達14-3-3ε。

注：1為未轉染組;2為轉染空載體pcDNA3.1-ZEO;3為轉染重組體 pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε。

圖3 Western blot檢測真核表達載體pcDNA 3.1-ZEO-HA-14-3-3ε在Hek293細胞中的表達

3 討 論

14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物體內，相對分子質量為(28～33)×103的酸性蛋白質。14-3-3蛋白家族成員是在1967年由Mooref和Perez首次在哺乳動物的腦組織中發(fā)現(xiàn)并鑒定,按照蛋白質系統(tǒng)分類命名法命名為14-3-3蛋白。14-3-3蛋白自我聚集成同或異二聚體,一些家族成員，如σ和γ偏嗜形成同二聚體,其他家族成員如ε偏嗜形成異二聚體。14-3-3二聚體能和細胞內許多蛋白質相互作用,包括許多轉錄因子、信號分子、凋亡因子和腫瘤抑制因子。功能涉及細胞生長、細胞周期限制點調控、信號轉導。14-3-3蛋白能和許多具有特殊磷酸化的絲/蘇氨酸結合活性的蛋白質相互作用。14-3-3結合蛋白有2個高親和14-3-3蛋白結合域:RSXpSXP(mode1)和RXXXpSXP(mode2),pS代表磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸，X指除半胱氨酸以外的任何一種氨基酸。另外14-3-3蛋白能結合RXXpSX-C00H模序[3-4]。通常與14-3-3蛋白相結合的靶蛋白都具有絲氨酸或蘇氨酸位點，14-3-3蛋白以其特有的保守模序與被磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸相結合，從而調節(jié)靶蛋白的生理活性[1]。到目前為止，已經鑒定出超過300種14-3-3人類結合蛋白，而且還有繼續(xù)增多的趨勢[5]。14-3-3蛋白能進行磷酸化修飾，當Ser-58磷酸化后14-3-3蛋白由二聚體轉變成單體，單體蛋白不穩(wěn)定，在結合和調節(jié)磷酸化蛋白時活性降低或者完全失去活性[6]。有研究顯示，14-3-3ε分子共有12個磷酸化位點，而且每個磷酸化位點與其對應的生物學活性還不清楚[7]。

有許多研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白在未受干擾的細胞周期進程中也發(fā)揮作用，例如，對發(fā)育中果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3ζ和ζ在細胞周期的調控中也發(fā)揮著作用，主要是通過抑制CDC2活性，使細胞在適當?shù)臅r候退出有絲分裂。敲除果蠅的14-3-3ε導致胚胎死亡，盡管14-3-3ε表達正常，然而14-3-3ε對胚胎的發(fā)育并不是必須的，14-3-3ε突變的胚胎細胞提前進入有絲分裂。

Uchida等[8]研究結果顯示，在HEK293細胞中14-3-3ε能與Cdc25B的309位絲氨酸結合并控制Cdc25B的細胞質定位。在小鼠卵母細胞由GV期向GVBD過渡時Cdc25B從細胞質進入細胞核，使Cdc2/cyclinB復合體發(fā)生去磷酸化并激活，從而使小鼠卵母細胞恢復減數(shù)分裂，暗示在細胞質中14-3-3蛋白和Cdc25B的結合[9-10]。

目前,國內少見小鼠 14-3-3ε真核表達載體的構建研究和14-3-3ε在小鼠卵母細胞和受精卵發(fā)育中作用和機制的相關研究。本研究采用RT-PCR從小鼠肝組織中克隆小鼠14-3-3ε基因,并成功構建14-3-3ε真核表達載體pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε。通過脂質體介導的方法將pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε載體轉染HEK293細胞后，Western blotting證實轉染細胞內14-3-3ε的表達，為下一步研究14-3-3ε基因的結構、功能及其在小鼠卵母細胞發(fā)育的調控作用奠定了良好的基礎。

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Gene cloning of mouse 14-3-3ε and construction of its eukaryotic expression vector*

MENGJun,HOUYan-jun，TANGTao,ZHANGYong-mei,LIUShan，LIUYang，Hugejile

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010050,China)

Objective To construct mouse′s eukaryotic expression vector pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε,and to examine its expression in vitro.Methods Total RNA was extracted from mouse liver tissue and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to obtain the cDNA fragment encoding 14-3-3ε,which was inserted into the pcDNA3.1-ZEO(+)vector.And the new construct,pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.HEK293 cells were transfected with the pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε vector and pcDNA3.1-ZEO(+) vector,respectively.The expression of 14-3-3ε was detected by Western blotting.Results The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε was constructed,and 14-3-3ε expression was detected in the HEK293 cells 48 h after transfection.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε was constructed successfully,which would lay the foundation for the mechanism research of 14-3-3ε in the G2/M transformation of mouse oocyte and oosperm.

14-3-3 ε protein; HEK293 cell; eukaryotic expression vector

國家自然科學基金資助項目(81360109)；內蒙古自然科學基金資助項目(2013MS1163)。

孟峻，男，博士，主任技師，主要從事生物化學和分子生物學研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.001

A

1672-9455(2015)24-3611-03

2015-03-25

2015-06-15)