張 龍，銀廣悅，武彩虹，王 輝，張朝云(中國石油中心醫(yī)院：.檢驗科;.急診科;.內(nèi)分泌科, 河北廊坊 065000)

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·論 著·

全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測乙肝核心抗體的加樣質(zhì)量控制*

張 龍1，銀廣悅1，武彩虹1，王 輝2，張朝云3(中國石油中心醫(yī)院：1.檢驗科;2.急診科;3.內(nèi)分泌科, 河北廊坊 065000)

目的 選擇TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測乙肝核心抗體(HBcAb)的理想檢測程序。方法 對同一樣本設(shè)置不同的加樣方式、加樣順序，獲得相應(yīng)的數(shù)據(jù)，比較檢測結(jié)果以確定理想檢測程序。結(jié)果 TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測HBcAb，加樣針存在拖帶現(xiàn)象，可能造成標(biāo)本污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，或污染陰性對照，使CO值降低，造成假陰性結(jié)果。通過改進加樣程序，減少攜帶概率，避免陰性對照污染，提高檢測質(zhì)量。結(jié)論 用單獨加樣方式，先加陰陽對照再加標(biāo)本的順序為理想的檢測程序。

乙肝核心抗體； 全自動酶聯(lián)免疫分析儀； 質(zhì)量控制

乙肝核心抗原(HBcAg)的強抗原性使接觸過或感染乙肝的人群產(chǎn)生大量的乙肝核心抗體(HBcAb)，HBcAb陽性提示此人有過乙肝(HBV)接觸史。TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀可以完全代替手工，具有加樣準(zhǔn)、速度快等優(yōu)點，但目前儀器加樣系統(tǒng)大多采用的是非一次性的Teflon涂層鋼針，當(dāng)遇到強陽性標(biāo)本時，由于加樣針未能進行徹底洗滌，導(dǎo)致了后一孔甚至多孔加樣拖帶陽性現(xiàn)象，甚至污染后面標(biāo)本，使之出現(xiàn)假陽性結(jié)果[1-3]。目前樣本拖帶污染問題日益受到廣泛關(guān)注。本研究旨在改進TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀的加樣程序，提高HBcAb的檢測質(zhì)量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取2014年4月中國石油中心醫(yī)院乙肝患者血清20份，HBcAb為強陽性，OD值在0～0.001之間，每份標(biāo)本后面對應(yīng)的同一根針加樣標(biāo)本OD值偏低，懷疑有加樣針攜帶污染情況，標(biāo)本無溶血、無脂血、無黃疸，每份標(biāo)本不少于2 mL，陰性標(biāo)本使用試劑自帶陰性對照，批號相同。

1.2 儀器與試劑 TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀，型號DK-1504。乙肝病毒表面抗原ELISA診斷試劑盒(英科新創(chuàng)，批號2013075509)。

1.3 方法 將收集的陽性標(biāo)本制作成混合血清，分成7組，定為P組，每組4個；試驗所用的陰性對照批號相同，編為A1組、A2組、B1組、B2組。具體方法如下：(1)方法A為儀器標(biāo)本位上1～4號為試劑自帶陰性對照組(A1組)，5～8號為P組標(biāo)本，9～12號為試劑自帶陰性對照組(A2組)，13～16號位放P組標(biāo)本，17～20號為試驗組A2，21～23號位分別為陽性對照、陰性對照、空白孔。(2)方法B為儀器標(biāo)本位上1～4號試劑自帶陰性對照B1組作為對照組，5～8號位放P組標(biāo)本,9～12號為試劑自帶陰性對照B2組作為試驗組，13～16號位放P組標(biāo)本，17～20號位不放標(biāo)本，在加樣時將B2組倒過來，21～24號位放P組標(biāo)本，25～28號位不編標(biāo)本，在加樣時再將B2組倒過來，29～31號位分別為陽性對照，陰性對照，空白孔。2次試驗均模擬日常乙肝5項檢驗，先將稀釋液(生理鹽水)290 μL加入HBcAb試劑微孔板中，加10 μL血清進行1∶30倍稀釋，并與其余4項同時加樣，即吸一次血清5項全加完，然后再從HBcAb試劑微孔中吸出250 μL已稀釋血清，剩余50 μL。(3)方法C為標(biāo)本編排同方法A，試驗順序變?yōu)镠BcAb單獨加樣，其他4項同時加樣，且陰陽對照提至加標(biāo)本之前。

2 結(jié) 果

2.1 方法A 觀察加樣針的攜帶現(xiàn)象，所用酶聯(lián)免疫分析儀有4根針，1～4號標(biāo)本作為對照組，后面每4個陽性標(biāo)本后跟著4個陰性對照作為試驗組，結(jié)果均值為2.192，結(jié)果明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 方法B 觀察加樣針的污染現(xiàn)象，1～4號作為對照組，后面每加1次陽性對照，加樣針接觸1次陰性對照，共接觸3次，結(jié)果均值為1.741，明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 3種方法試驗結(jié)果對比 方法C作為糾正后加樣方案，陰性對照組結(jié)果沒有明顯變化。方法A評價單次吸樣陽性標(biāo)本對后面標(biāo)本或陰性對照的污染和拖帶現(xiàn)象。方法B是多次吸樣陽性標(biāo)本，多次接觸陰性對照，是對陰性對的污染情況評價。方法C與前兩次試驗作比較，評價調(diào)整加樣程序?qū)Y(jié)果的影響。見表1。

表1 3種方法試驗結(jié)果對比表(OD)

注：與對照組比較，△P<0.05。

3 討 論

HBcAb是病毒刺激肝細胞產(chǎn)生的一種免疫球蛋白,它是感染病毒后最早呈陽性,也是最晚轉(zhuǎn)陰性的一項，其陽性不僅代表乙肝接觸史，也可能是隱性乙肝病毒感染后的一種表現(xiàn)，由于HBcAb并不作為診斷指標(biāo)，往往HBcAb陽性標(biāo)本不被復(fù)查，一直以來HBcAb的陰性對照穩(wěn)定性很差，尤其是不及時更換陰性對照情況下，時常陰性對照OD值明顯下降，而此OD值直接用來計算CO值，其結(jié)果對于HBcAb滴度低的標(biāo)本造成假陰性結(jié)果。

HBcAg的強抗原性，使既往接觸史人群或乙肝患者人群產(chǎn)生大量的HBcAb，而且目前試劑的靈敏度能達到納克水平，很可能造成全自動酶免疫的加樣攜帶現(xiàn)象，已有文獻報道加樣針污染標(biāo)本的情況。雖然酶聯(lián)免疫分析儀加樣針有特殊涂層，能有效地防止掛液現(xiàn)象，但大多醫(yī)院只用去離子水清洗鋼針，一旦遇到高滴度標(biāo)本或高黏度樣本時，加樣針往往不能沖洗干凈，從而造成攜帶現(xiàn)象[5]。儀器在加樣過程中，為了加樣量的準(zhǔn)確，吸樣完成后再吐出部分標(biāo)本，并且隨著鋼針被重復(fù)使用次數(shù)的增加，其內(nèi)壁可能吸附蛋白質(zhì)或脂質(zhì)等污物，這樣攜帶的殘留直接污染下一標(biāo)本，方法A、方法B中的試驗組標(biāo)本明顯已被污染，而且接觸陽性標(biāo)本次數(shù)越多污染越嚴(yán)重[6-7]。

綜上所述，HBcAb在日常檢測中的質(zhì)量難以保證，以往，檢測乙肝5項一般是5項平行加樣，加樣針內(nèi)吸樣至少235 μL，雖然加樣針內(nèi)部經(jīng)過了特殊處理，單靠去離子水仍然難以徹底清洗干凈；改變流程后，單加HBcAb，吸樣10 μL就可以，很大程度減少了標(biāo)本與加樣針內(nèi)部的接觸面積，也就減少了殘留，降低了加樣針攜帶概率。陰陽對照調(diào)整為先加，這樣可以避免加樣針對陰性對照的污染，確保CO值的準(zhǔn)確、穩(wěn)定，由此，用TECAN全自動酶聯(lián)免疫分析儀DK1504檢測乙肝5項中的HBcAb，方法C是較為理想的工作程序。

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Quality control of adding sample on HBcAb by automatic enzyme immunoassay instrument*

ZHANGLong1,YINGuang-yue1,WUCai-hong1,WANGHui2,ZHANGChao-yun3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofEmergency;3.DepartmentofEndocrinology,CentralHospitalofChinaNationalPetroleumCorporation,Langfang,Hebei065000,China)

Objective To select the ideal examination program of the TECAN automatic enzyme immunoassay instrument for detecting HBcAb.Methods The different adding modes and adding sequences were set on the same sample for obtaining the corresponding data. Results In detecting HBcAb by the TECAN automatic enzyme immunoassay instrument,adding sample needle had the entrainment phenomenon,which could cause the sample contamination,thus led to false positive results or contaminated the negative control to make the CO value decrease and cause the false negative result. The improvement of adding sample program reduced the carrying probability,avoided the negative control pollution and increased the detection quality.Conclusion Adopting the single adding sample mode,and first adding negative and positive control and then sample are the ideal detection program.

HBcAb; automatic enzyme immunoassay instrument; quality control

河北省廊坊市科技局項目(2013013020C)。

張龍，男，主管檢驗師，本科，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量控制方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.017

A

1672-9455(2015)16-2342-02

2015-01-25

2015-04-15)