祁松楠，忻寅強(qiáng)，王 琳，趙瑞柯，黃寶麗，彭群新，史進(jìn)方，顧國(guó)浩，馬 青，蔣 敏△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科/江蘇省臨床免疫學(xué)研究所，江蘇蘇州 215000；2.中國(guó)科 學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所納米生物醫(yī)學(xué)研究部，江蘇蘇州 215000)

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·論 著·

非小細(xì)胞肺癌患者血清細(xì)胞因子的檢測(cè)及其臨床意義**

祁松楠1，忻寅強(qiáng)2，王 琳1，趙瑞柯1，黃寶麗1，彭群新1，史進(jìn)方1，顧國(guó)浩1，馬 青2，蔣 敏1△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科/江蘇省臨床免疫學(xué)研究所，江蘇蘇州 215000；2.中國(guó)科 學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所納米生物醫(yī)學(xué)研究部，江蘇蘇州 215000)

目的 探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的量值變化在NSCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法 采用蛋白芯片法檢測(cè)50例NSCLC患者及50例健康者血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF的濃度。結(jié)果 與健康對(duì)照組比較，NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF濃度明顯升高(P<0.01)，MCP-1濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者血清IL-6濃度明顯升高(P<0.01)，血清MCP-1濃度降低(P<0.05)，血清GM-CSF濃度明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-8濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清IL-6濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-8、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與肺鱗癌患者相比，肺腺癌患者血清IL-8濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-6、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF的改變與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其血清學(xué)檢測(cè)有助于了解NSCLC患者的免疫功能狀態(tài)，對(duì)NSCLC分期、分型具參考價(jià)值。

非小細(xì)胞肺癌； 白細(xì)胞介素6； 白細(xì)胞介素8； 單核細(xì)胞趨化蛋白1； 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子； 蛋白芯片法

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。世界衛(wèi)生組織2012年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的發(fā)病率和病死率分別為13.0%和19.4%，居所有腫瘤之首，已成為全球性的健康威脅[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見(jiàn)的一類(lèi)，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。機(jī)體存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子工作網(wǎng)絡(luò)，各種細(xì)胞因子互相協(xié)調(diào)共同維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)態(tài)，而細(xì)胞因子與腫瘤的關(guān)系一直是腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。多種細(xì)胞因子聯(lián)合定量檢測(cè)是判斷機(jī)體免疫功能的有效方法，具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究采用高靈敏度、高通量的蛋白芯片法檢測(cè)NSCLC患者和健康者血清中的細(xì)胞因子濃度，并結(jié)合NSCLC患者的臨床資料探討其在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用和意義，為NSCLC患者免疫功能評(píng)價(jià)和免疫治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年4～9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的初診NSCLC患者50例，其中男26例，女24例，平均年齡(67.4±9.6)歲。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，其中鱗癌22例，腺癌28例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期13例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例，Ⅳ期14例。收集同期本院預(yù)防保健科健康體檢者50例，其中男26例，女24例，平均年齡(65.5±6.3)歲。NSCLC組和健康對(duì)照組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；颊吲c健康對(duì)照者均知情同意。

1.2 儀器與試劑 EZ-Plex Human Cytokine 4-plex細(xì)胞因子檢測(cè)芯片(蘇州偲聚生物材料有限公司)、GE Image Quant LAS 4000 mini 化學(xué)成像分析儀(美國(guó)General Electric Company)、TS-1脫色搖床(杰瑞爾電器有限公司)、QL-901X型漩渦混合器(海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)、LX-100手掌型離心機(jī)(海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集肺癌患者及健康對(duì)照組清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h后以3 000 r/min離心10 min，將血清分裝后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 血清細(xì)胞因子定量檢測(cè)采用蛋白芯片夾心法。首先制備標(biāo)準(zhǔn)品并根據(jù)需要進(jìn)行稀釋?zhuān)瑫r(shí)使用樣品稀釋液以1∶10稀釋血清樣本。取出蛋白芯片并于室溫下平衡20 min，從加樣孔往每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)加入洗液 200 μL潤(rùn)洗，靜置3 min；使用移液槍將洗液吸盡后加入200 μL配置好的血清樣品液或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫、150 r/min孵育2 h，洗滌芯片后加入檢測(cè)抗體混合液200 μL，室溫、150 r/min孵育1 h；洗滌芯片，加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素溶液200 μL，室溫、150 r/min孵育0.5 h；洗滌芯片后向芯片表面滴加等比混好的發(fā)光底物液30 μL，將發(fā)光架移入化學(xué)發(fā)光成像儀中成像，所得圖像使用GenePix pro6.0軟件進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品濃度(pg/mL)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料不服從正態(tài)分布，以M(Q1,Q3)形式表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC和健康對(duì)照組血清各細(xì)胞因子濃度 與健康對(duì)照組比較，NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF濃度明顯升高(P<0.01)，MCP-1濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組和健康對(duì)照組血清各細(xì)胞因子濃度[M(Q1,Q3)，pg/mL]

表2 NSCLC患者不同病理狀態(tài)下血清各細(xì)胞因子濃度[M(Q1,Q3),pg/mL]

2.2 NSCLC不同病理狀態(tài)下血清各細(xì)胞因子濃度的比較 依據(jù)NSCLC患者不同臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析分組，比較分析發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者血清IL-6濃度明顯升高(P<0.01)，血清MCP-1濃度降低(P<0.05)，血清GM-CSF濃度明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-8濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清IL-6濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-8、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與肺鱗癌患者相比，肺腺癌患者血清IL-8濃度升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-6、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生的一類(lèi)分泌型糖蛋白，其以多種多樣的生物學(xué)活性，在體內(nèi)構(gòu)成功能性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，彼此協(xié)作或相互制約，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、造血功能，對(duì)維持機(jī)體正常的免疫功能狀態(tài)起著非常重要的調(diào)控作用。在異常情況下，細(xì)胞因子也會(huì)成為一系列病理過(guò)程的重要介質(zhì)，參與炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生[2]。血清中細(xì)胞因子含量普遍較低，傳統(tǒng)的ELISA方法難以達(dá)到良好的檢測(cè)效果。本研究采用高靈敏度、高通量的蛋白芯片法(可同時(shí)檢測(cè)數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)指標(biāo))，其基本技術(shù)手段是基于一種新型的固體支撐材料——改性聚二甲基硅氮烷(iPDMS)，iPDMS獨(dú)特的表面化學(xué)能夠有效地固定蛋白質(zhì)并保持其生物活性，在復(fù)雜環(huán)境下仍然能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的“絕對(duì)零”非特異性吸附，從而保證其滿足體外診斷的要求[3]?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，本研究使用iPDMS作為載體，同時(shí)高效地檢測(cè)肺癌患者血清中多種細(xì)胞因子濃度。

IL-6和IL-8都屬于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中具有多種效應(yīng)的炎性介質(zhì)，其產(chǎn)生受多種因素的調(diào)控，一方面可由機(jī)體免疫系統(tǒng)接受病毒、脂多糖、糖皮質(zhì)激素等的刺激后產(chǎn)生，另一方面，當(dāng)機(jī)體處于荷瘤狀態(tài)時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生這類(lèi)細(xì)胞因子[4-5]。IL-6主要通過(guò)介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，刺激腫瘤新生血管生成[6]。IL-8也具有調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的作用，通過(guò)促進(jìn)腫瘤組織血管的生成來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。本研究顯示，NSCLC患者血清IL-6、IL-8濃度顯著高于健康對(duì)照組，IL-6隨著病理分期的增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而升高，提示IL-6在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這與陳春莉等[8]的研究結(jié)果基本一致。多項(xiàng)研究表明，血清IL-6和IL-8濃度升高是NSCLC預(yù)后不良的指標(biāo)，血清IL-6和IL-8濃度的檢測(cè)有助于了解患者的免疫功能狀態(tài)、判斷疾病進(jìn)展和評(píng)估預(yù)后[9-10]。本研究還發(fā)現(xiàn)肺腺癌血清IL-8濃度顯著高于肺鱗癌，而此前未見(jiàn)有關(guān)血清IL-8濃度在NSCLC不同組織類(lèi)型中表達(dá)濃度不一的報(bào)道，王振元等[11]在應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)研究肺癌組織IL-8 mRNA表達(dá)時(shí)曾發(fā)現(xiàn)肺腺癌IL-8 mRNA表達(dá)高于其他組織學(xué)類(lèi)型的肺癌，對(duì)于此現(xiàn)象的產(chǎn)生原因仍不清楚，可能與肺腺癌的一些生物學(xué)行為相關(guān)，如肺腺癌在早期即可侵犯血管和淋巴管，常在原發(fā)瘤引起癥狀前即已轉(zhuǎn)移。

MCP-1是一種具有重要生理作用的趨化因子，可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等接受一定刺激后誘導(dǎo)分泌，在體內(nèi)發(fā)揮介導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)血細(xì)胞發(fā)育、胚胎器官發(fā)育、血管生成、細(xì)胞凋亡等作用。GM-CSF是一種多功能造血因子，可以選擇性地刺激粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖、分化和成熟。體外研究表明，將表達(dá)MCP-1的纖維母細(xì)胞和癌細(xì)胞共同接種動(dòng)物時(shí)，其能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；而添加GM-CSF培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞用于治療早期和復(fù)發(fā)性NSCLC的研究也已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)階段，表明MCP-1和GM-CSF具有抗腫瘤活性[12-13]。本研究顯示，NSCLC患者血清MCP-1、GM-CSF濃度高于健康對(duì)照組，這些炎性因子的升高一方面反映了機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮積極的抗腫瘤效應(yīng)，另一方面細(xì)胞因子、趨化因子的持續(xù)存在和由其引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，趨化炎性細(xì)胞聚集，增加活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA氧化損傷，有DNA損傷或發(fā)生了基因突變的增殖細(xì)胞在富含炎性細(xì)胞和多種生物因子的微環(huán)境中繼續(xù)失控性增殖，修復(fù)程序混亂，最終癌變，也反映了細(xì)胞因子作用網(wǎng)絡(luò)的雙向性和復(fù)雜性[14]。腫瘤微環(huán)境中組成性表達(dá)的MCP-1、GM-CSF對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程有著重要作用，MCP-1、GM-CSF均可通過(guò)招募多種炎性細(xì)胞、加速血管生成的作用來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[15-16]。本研究顯示，MCP-1和GM-CSF濃度在腫瘤后期出現(xiàn)下降，推測(cè)可能是由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因子所導(dǎo)致。

細(xì)胞因子濃度的改變與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)細(xì)胞因子的血清學(xué)檢測(cè)有助于及時(shí)了解患者的免疫功能狀態(tài)，評(píng)估腫瘤病變的分期和預(yù)后轉(zhuǎn)歸等，其同時(shí)也提示對(duì)于NSCLC的治療可以通過(guò)干預(yù)細(xì)胞因子通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而目前細(xì)胞因子血清學(xué)檢測(cè)未得到足夠的重視和普及，究其原因可能是由于細(xì)胞因子在血清中含量較低，缺乏高靈敏度、高通量的檢測(cè)平臺(tái)，而蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)的建立為血清細(xì)胞因子的檢測(cè)提供了高靈敏度、高通量、低成本的檢測(cè)平臺(tái)，具有很高的臨床應(yīng)用前景。

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Detection and clinical significance of serum cytokines in patients with non-small cell lung cancer*

QISong-nan1,XINYin-qiang2,WANGLin1,ZHAORui-ke1,HUANGBao-li1,PENGQun-xin1，SHIJin-fang1,GUGuo-hao1,MAQing2,JIANGMin1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory/JiangsuProvincialResearchInstituteofClinicalImmunology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215000,China;2.ResearchDepartmentofNanoBiomedicine,SuzhouNanotechnologyandNanometerBionicResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Suzhou,Jiangsu215000,China)

Objective To investigate the role of changes of serum interleukin-6(IL-6),interleukin-8(IL-8),monocyte chemotactic protein(MCP-1) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) levels in the patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods The levels of serum IL-6,IL-8,MCP-1 and GM-CSF in cases of 50 NSCLC and 50 healthy controls were measured by adopting the protein microarray.Results Compared with the healthy control group,serum IL-6,IL-8 and GM-CSF levels were increased evidently(P<0.01),while serum MCP-1 level was increased (P<0.05) in the patients with NSCLC,the differences were statistically significant(P<0.05;compared with the patients with the stage Ⅰ+Ⅱ NSCLC,serum IL-6 level in the stage Ⅲ+Ⅳ was increased evidently(P<0.01),while serum MCP-1 levels was decreased (P<0.05),serum GM-CSF level in the patients with the stage Ⅲ+Ⅳ NSCLC was decreased evidently,the differences were statistically signifiant(P<0.01),there was no statistically significant difference in serum IL-8 level(P>0.05).The serum IL-6 level of the NSCLC patients with lymph node metastasis was significantly higher than that without lymph node metastasis (P<0.05),and there were no statistically significant differences in serum IL-8,MCP-1 and GM-CSF levels(P>0.05).The serum IL-8 level of lung adenocarcinoma patients was significantly higher than that of lung squamous cancer patients(P<0.05),and there were no statistically significant difference in serum IL-6,MCP-1 and GM-CSF levels(P>0.05).Conclusion The changes of serum IL-6,IL-8,MCP-1 and GM-CSF levels may be closely related to the occurrence and progression of NSCLC,their serological tests conduces to understand the immune function status of NSCLC patients and has the reference value in the staging and typing of NSCLC.

NSCLC； IL-6； IL-8； MCP-1； GM-CSF； protein microarray

江蘇省蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYS201329)。

祁松楠，女，初級(jí)檢驗(yàn)師，碩士，主要從事肺癌早期診療方面的研究。

△通訊作者，E-mail：jiangmin_111@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.016

A

1672-9455(2015)16-2339-03

2015-01-25

2015-03-15)