王 曉，陳 華(.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 635000；.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 4040)

?

·論 著·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用*

王 曉1，陳 華2(1.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 635000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 404202)

目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。方法 利用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌AngⅡ(0.1 μmol/L)誘導(dǎo)制備心肌細(xì)胞肥大模型，檢測EGCG(0.5、1.0、2.0 μmol/L)干預(yù)后，心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液一氧化氮(NO)濃度和一氧化氮合酶 (NOS)及Ca2+-ATP酶活性，同時(shí)檢測心肌細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN) mRNA的表達(dá)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶α-亞基(CnA)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 對照組的AngⅡ使心肌細(xì)胞發(fā)生明顯肥大，細(xì)胞內(nèi)NOS和Ca2+-ATP酶活性下降，而CaN mRNA和CnA蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EGCG不同劑量組均明顯減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大程度，增加NOS和Ca2+-ATP酶活性，促進(jìn)NO釋放，下調(diào)CaN mRNA和減少CnA蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 EGCG抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用機(jī)制可能與EGCG增加NO釋放，升高NOS和Ca2+-ATP酶活性，抑制CaN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及降低CnA蛋白表達(dá)有關(guān)。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯； 心肌細(xì)胞肥大； Ca2+-ATP酶； 一氧化氮合酶； 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶

心臟肥大的形成是由于高血壓、慢性心功能不全等多因素長期刺激發(fā)生的復(fù)雜病理過程,這期間心肌細(xì)胞和間質(zhì)部分均發(fā)生明顯變化，內(nèi)皮縮血管肽和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等因子刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白合成和體積增加，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)[1]。AngⅡ是體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)主要活性物質(zhì)之一，其作用于心肌胞膜AT1激活多種信號級聯(lián)反應(yīng)，激活心肌發(fā)生增厚、重構(gòu)[2]。心肌肥大己被列為心血管發(fā)病率和病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對其發(fā)病機(jī)制和防治的研究一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但臨床防治藥物都有一定不良反應(yīng)而影響臨床治療目標(biāo)。流行病學(xué)研究顯示黃酮類可以減少心臟疾病的病死率。綠茶中茶多酚重要的組分主要含4個(gè)單體，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，其中EGCG占苯多酚的30%～35%。研究表明EGCG具有抗氧化、抗炎等作用，對神經(jīng)細(xì)胞損傷、糖尿病大鼠腎臟及大鼠酒精性肝損傷都具有一定的保護(hù)作用[3]。此外，EGCG能夠抑制大鼠心肌肥厚膠原生成和細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)[4]。近年來研究證實(shí)EGCG具有抗氧化、多靶點(diǎn)保護(hù)心肌等功能，對心肌肥大具有潛在的防治作用[5]。本實(shí)驗(yàn)用AngⅡ誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞肥大模型，通過檢測心肌細(xì)胞一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、Ca2+-ATP酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶α-亞基(CnA)的變化情況，探討EGCG用于抗心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制，為EGCG用于預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠種鼠75只，出生1～2 d清潔級SD大鼠，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號:SYXK(渝) 20022007。

1.1.2 儀器與試劑 儀器采用Real-Time PCR擴(kuò)增儀 (美國BIO-RAD公司),凝膠成像儀Mini Trans-Bloe電泳儀(美國BIO-RAD公司),電轉(zhuǎn)儀(美國BIO-RAD公司)，Leica光學(xué)顯微鏡(德國Leica Microsystems Ltd公司)。試劑采用EGCG、胎牛血清、胰酶、抗β-actin抗體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(重慶市卓諾生物技術(shù)有限公司)，AngⅡ、CnA小鼠抗大鼠單克隆抗體(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基GIBCO產(chǎn)品，NO測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，NOS測定試劑盒、Ca2+-ATP酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、SYBR?GREEN PCR Master Mix(Applied Bio-system公司)，內(nèi)參GAPDH、CaN、NOS引物(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 50只大鼠隨機(jī)分組為對照組，模型組(AngⅡ+0.1 μmol/L EGCG)，EGCG低劑量(AngⅡ+0.5 μmol/L EGCG)組，EGCG中劑量(AngⅡ+1.0 μmol/L EGCG)組；EGCG高劑量(AngⅡ+2.0 μmol/L EGCG)組。EGCG粉劑用二甲基亞砜溶解后DMEM稀釋，配置成濃度為0.5、1.0、2.0 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液備用。換無血清培養(yǎng)液24 h后加入0.1 μmol/L AngⅡ或0.1 μmol/L AngⅡ加上述不同劑量EGCG，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后檢測。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)AngⅡ組心肌細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞腫脹，分界不清；AngⅡ合用EGCG組細(xì)胞明顯縮小，腫脹程度減輕。

1.2.2 乳鼠心肌細(xì)胞制備 取新生1～2 d SD乳鼠心室肌切碎加入0.25%胰蛋白酶消化，D-Hank′s液混懸后用不銹鋼篩過濾，加入胎牛血清終止消化、離心，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸后收集心肌細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)(1 h后加入0.1 mm 5′-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷)，免疫組化鑒定細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞上清液NO濃度、NOS活性的測定 取上清液作心肌細(xì)胞NO、NOS活性測定。其中一部分1 000 r/min離心5 min后收集上清液，-20 ℃保存，供NO測定；其余3 000 r/min離心10 min同法收集上清液，檢測NOS活性。NO和NOS均采用比色法測定，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作。取540 nm波長測定NO2-與Griess試劑反應(yīng)生成櫻紅色的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每孔NO水平。在530 nm波長下測定的吸光度，代表NOS活性，根據(jù)吸光度的大小計(jì)算出NOS活力。

1.2.4 Ca2+-ATP酶活性測定 將培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞，用無菌PBS(pH7.35～7.45)漂洗3次，給藥8 h后，胰酶消化細(xì)胞，胎牛血清培養(yǎng)基中和胰酶，生理鹽水稀釋后離心20 min(3 000 r/min)，棄盡上清液后破碎細(xì)胞酶促反應(yīng)測定磷，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。嚴(yán)格按照試劑盒說明書所述方法進(jìn)行操作。

1.2.5 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測CaN基因表達(dá) 采用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CaN基因的表達(dá)。從GeneBank中查出大鼠CaN基因的mRNA序列，利用美國PE公司引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)移性引物，由上海吉凱基因公司合成。引物序列見表1。取1×106心肌細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA純度。采用反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA(PrimeScriptTMBuffer 4.0 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix1.0 μL，OligodT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，Total RNA 1 μL)。按SYBR?GREEN PCR Master Mix條件進(jìn)行擴(kuò)增。見表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR的引物序列

1.2.6 Western-blot檢測心肌細(xì)胞中CnA蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 細(xì)胞經(jīng)藥物處理，胰酶消化，預(yù)冷的PBS洗3次，加入裂解緩沖液100 μL，超聲破碎細(xì)胞膜，15 000 r/min離心20 min，提取上清液蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法測定樣品蛋白水平。灌制10%聚乙酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗CnA小鼠抗大鼠單克隆抗體(1∶1 500)4 ℃孵育過夜，加入辣根酶標(biāo)記二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL顯色。GAPDH作為內(nèi)參對照，進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)比較。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞NO濃度和NOS活性的變化 與對照組比較，模型組NO的濃度和NOS的活性明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，EGCG加藥組(0.5、1.0、2.0 μmol/L)上述指標(biāo)均增加，EGCG各劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶和CaN mRNA表達(dá)的變化 與對照組比較，模型組Ca2+-ATP酶活性明顯降低，不同劑量EGCG均能使Ca2+-ATP酶活性較模型組明顯升高(P<0.05)。同樣EGCG各劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ明顯上調(diào)CaN mRNA的表達(dá)，EGCG各劑量組明顯抑制AngⅡ所致CaN mRNA表達(dá)的增加。見表3。

表2 EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞NO和NOS

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

圖1 EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中CnA

2.3 AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中CnA蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果表明，與對照組比較，模型組明顯增加了心肌細(xì)胞CnA蛋白表達(dá)；與模型組比較，EGCG各劑量組均可以降低AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的CnA蛋白表達(dá)量。見圖1。

表3 EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中Ca2+-ATP酶

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

心肌肥厚是各種因素引起心肌工作超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，心肌細(xì)胞肥大是心肌肥厚病理生理學(xué)變化的重要基礎(chǔ)，內(nèi)皮素-1、兒茶酚胺和體液因子AngⅡ是致心肌肥厚的重要因素。AngⅡ是經(jīng)典的心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)是心血管科研常用造模方法之一，AngⅡ誘導(dǎo)并參與心肌細(xì)胞的整個(gè)病理過程。AngⅡ誘導(dǎo)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大包括多條胞內(nèi)信號途徑及細(xì)胞直徑和蛋白質(zhì)合成增加等表型改變[2-6]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法建立了大鼠心肌細(xì)胞肥大模型，實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞模型出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞體積增加、細(xì)胞腫脹等病理學(xué)改變形態(tài)變化；與模型組比較，EGCG不同劑量組均能抑制心肌細(xì)胞的肥大，細(xì)胞明顯縮小，腫脹程度減輕。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M幼鼠心肌細(xì)胞NOS活性和NO濃度均降低，在培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中血管緊張素通過其受體及G蛋白耦聯(lián)受體，一方面引起心肌細(xì)胞肥大；另一方面抑制一氧化氮合酶活性和NO生成。在心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展過程中，除了致心肌肥厚的因素外，機(jī)體必然有一些防止心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展的因子，內(nèi)皮舒張因子NO是重要的候選因子之一，內(nèi)源性NO可通過依賴機(jī)制減輕壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚[7]。EGCG抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大同時(shí)明顯升高NOS活性并增加心肌細(xì)胞上清液NO濃度，而心臟中NO濃度升高除可引起冠脈舒張、冠脈血流量增加和心肌收縮力下降外，在防止心肌肥厚反應(yīng)中也起重要作用[8-9]。

心肌肥厚常伴有肌漿網(wǎng)鈣泵活性降低、鈣離子紊亂，心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶通過攝取和釋放Ca2+在心臟的舒縮活動中發(fā)揮著重要作用[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ誘導(dǎo)幼鼠心肌細(xì)胞Ca2+-ATP酶活性明顯下降(P<0.05)，Ca2+-ATP酶活性的降低可引起鈣循環(huán)紊亂，鈣超載是形成心肌肥厚的主要機(jī)制之一，也是心肌舒縮功能障礙的重要病理生理機(jī)制。CaN是目前發(fā)現(xiàn)的唯一受鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲蘇氨酸蛋白磷酸酶，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加可激活Ca2+敏感的CaN，近年研究發(fā)現(xiàn)CaN在心肌肥厚的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，抑制活性可預(yù)防心肌肥厚的發(fā)生[11]。檢測結(jié)果顯示EGCG不同劑量組Ca2+-ATP酶活性比對照組明顯升高(P<0.05)，CaN表達(dá)量反之(P<0.05)。這一結(jié)果意味著EGCG對Ca2+-ATP酶活性和CaN表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用可能也是EGCG抗心肌細(xì)胞肥厚的機(jī)制之一。

此外，鈣調(diào)素結(jié)合可誘發(fā)CnA構(gòu)象改變，暴露其磷酸酶活性位點(diǎn)，活化的CnA激活多種心肌肥大相關(guān)基因，同時(shí)誘導(dǎo)原癌基因表達(dá)，使心肌胚胎化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積增大，蛋白核酸合成增加，發(fā)生心肌重構(gòu)[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG各劑量組均能不同程度降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌CnA表達(dá)，抑制CaN信號通路，表明其抗心肌細(xì)胞肥大作用可能與EGCG抑制CaN信號通路有關(guān)。

綜上所述，EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大抑制的作用與EGCG促進(jìn)NO的釋放，調(diào)節(jié)Ca2+-ATP酶和CaN mRNA表達(dá)的增加，降低CnA蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]Mosterd A，Hoes AW，Bruyne MC，et al．Prevalence of heart failure and left ventricular dysfunction in the general population：the rotterdam study[J]．Eur Heart J，1999，20(1)：447-455．

[2]Nakagami H,Takemoto M,Liao JK,et al.NADPH oxidase-derived superoxide anion mediates angiotensin II-induced cardiac hypertrophy[J].J Mol Cell Cardiol,2003，35(7):851-859.

[3]葛斌,謝梅林,顧正倫.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠高脂性脂肪肝的治療作用及其機(jī)制研究[J]．中國藥理學(xué)通報(bào),2009，25(4),510-514.

[4]盛瑞，顧振綸，謝梅林.EGCG抑制心肌肥厚膠原生成和細(xì)胞增殖[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(9)：1095-1099.

[5]崔文明,毛偉峰,杜海方.茶多酚和表沒食子兒茶素沒食子酸酯對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大的抑制作用[J].2008,33(3):356-359.

[6]Clerk A,Cullingford TE,Fuller SJ,et al.Signaling pathways mediating cardiac myocyte gene expression in physiological and stress responses[J].Cell Physiol,2007，212(2):311-322.

[7]Hunyady L,Turu G.The role of the AT1 angiotensin receptor in cardiac hypertrophy:angiotensin II receptor or stretch sensor[J].Trends Endocrinol Metab,2004,15(9):405-408.

[8]Massion PB,Balligand JL.Modulation of cardiac contraction,relaxation and rate by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS):lessons from genetically modified mice[J].J Physiol,2003,546(1):63-75.

[9]Ozaki M,Kawashima S,Yamashita T,et al.Overexpression of endothelial nitric oxide synthase attenuates cardiac hypertrophy induced by chronic isoproterenol infusion[J].Circ J,2002,66(9):851-856.

[10]黃志明,梁鋼，許盈.EGCG對腎缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,19(4):496-498.

[11]Clint L,Cai Y,Masayoshi O,et al.Role of Ca2+/calmodulin-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase 1 in mediating cardiomyocyte hypertrophy[J].Circ Res,2009,105(10):956-964.

[12]Rinne A,Kapur N,Molkentin JD,et al.Isoform-and tissue-specific regulation of the Ca2+-sensitive transcription factor NFAT in cardiac myocytes and in heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(6):2001-2009.

Inhibitory effect of EGCG on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ*

WANGXiao1,CHENHua2

(1.DepartmentofGastroenterology,DazhouMunicipalCentralHospital,Dazhou,Sichuan635000,China;2.DepartmentofBasicMedicine,ThreeGorgesMedicalCollege,Chongqing404202,China)

Objective To investigate the inhibitory effect of epigallocatechin gallate(EGCG) on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ(AngⅡ) and its potential mechanisms.Methods The primarily cultured cardiomyocyte AngⅡ(0.1 μmol/L) from sprague dawley neonatal rats was adopted to induce and prepare the cardiomyocyte hypertrophy model.The nitric oxide (NO) content,activity of nitric oxide synthetase (NOS) and Ca2+-ATPase activity in the supernatant fluid of cardiomyocytes culture after EGCG (0.5,1.0,2.0 μmol/L) intervention were measured.Meanwhile the mRNA expressions of calcineurin (CaN) in cardiomycytes were detected by real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The protein expression of calcineurin catalytic subunit (CnA) was detected by Western blot.Results AngⅡ in the blank control group induced significant cardiomyocytes hypertrophy,intracellular NOS and Ca2+-ATPase activity decrease,while CnA protein content and CaN mRNA expression increase(P<0.05),different doses of EGCG significantly alleviated AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophic degree,increased the activity of NOS and Ca2+-ATPase,promoted the NO release,but down-regulated CaN mRNA and decreased CnA protein expression(P<0.05).Conclusion The mechanism of EGCG inhibiting Ang Ⅱ induced cardiomyocyte hypertrophy could be related with EGCG increasing NO release,elevating NOS and Ca2+-ATPase activity,inhibiting CaN signal transduction pathway and decreasing CnA protein expression.

EGCG; cardiomyocyte hypertrophy; Ca2+-ATP; NOS; CaN

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyjA10049);重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(20121096)。

王曉，男，主治醫(yī)師，本科，主要從事消化內(nèi)科方面的臨床工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.012

A

1672-9455(2015)16-2328-03

2015-02-28

2015-04-15)