范任華，向延根，楊 勵(lì)，劉艷科，尹 柯，封文軍，許憶新，謝和賓，傅滿姣，吳佳玲，王 雷，張 婷 (湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院 410004)

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·論 著·

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+CD127low在抗多耐藥肺結(jié)核治療中的意義*

范任華，向延根，楊 勵(lì)△，劉艷科，尹 柯，封文軍，許憶新，謝和賓，傅滿姣，吳佳玲，王 雷，張 婷 (湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院 410004)

目的 探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+CD127low在西藥聯(lián)合中藥復(fù)方“益肺通絡(luò)方”抗多耐藥結(jié)核患者中的免疫調(diào)節(jié)作用。方法 選取多耐藥結(jié)核病(MDR-TB)住院患者34例，隨機(jī)分成標(biāo)準(zhǔn)化療(西藥)組12例作為對(duì)照組，中藥復(fù)方聯(lián)合西藥組22例作為試驗(yàn)組，并簽署知情同意書，按臨床試驗(yàn)方案抗結(jié)核治療，第0、3、6、9個(gè)月時(shí)分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血，經(jīng)CD4、CD25、CD127流式抗體標(biāo)記后，Beckman流式細(xì)胞儀(FCM)計(jì)數(shù)各組CD4+CD25+CD127low百分比。結(jié)果 隨服藥時(shí)間推移，對(duì)照組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；與對(duì)照組MDR-TB患者比較，試驗(yàn)組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。結(jié)論 經(jīng)過(guò)9個(gè)月的抗結(jié)核治療，試驗(yàn)組能有效降低MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比，中藥復(fù)方可能協(xié)同西藥下調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制，恢復(fù)結(jié)核病患者機(jī)體免疫平衡狀態(tài)。因此，中藥復(fù)方聯(lián)合西藥抗多耐藥結(jié)核患者治療也許是一個(gè)有益的幫助。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 多耐藥肺結(jié)核； 抗結(jié)核治療

肺結(jié)核嚴(yán)重威脅人類健康，全球約有20億肺結(jié)核帶菌者，而我國(guó)結(jié)核患者人數(shù)居世界第二位，形勢(shì)非常嚴(yán)峻[1]。結(jié)核分枝桿菌對(duì)常用抗結(jié)核藥物構(gòu)成抗藥性，導(dǎo)致發(fā)病率上升以及多耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有的抗結(jié)核治療構(gòu)成嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[2-3]。結(jié)核病免疫功能紊亂涉及到特異性的細(xì)胞免疫、體液免疫和多種免疫調(diào)節(jié)因子，有不同程度的免疫功能低下或免疫抑制，單純抗結(jié)核藥物化療很難收到較好療效。因此，對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行抗結(jié)核藥物化療外，輔以免疫調(diào)節(jié)功能的低不良反應(yīng)的中草藥，恢復(fù)機(jī)體免疫功能平衡，增強(qiáng)患者對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性，達(dá)到抑制或殺滅結(jié)核菌，提高耐藥結(jié)核病的治愈率。因此，從天然藥物中尋找安全有效的抗結(jié)核藥物，用于臨床治療和輔助治療耐藥性結(jié)核病，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年11月至2014年9月本院收治的多耐藥結(jié)核病(MDR-TB)患者34例，其中男20例，女14例，平均(47.3±14.2)歲，隨機(jī)分成標(biāo)準(zhǔn)化療(西藥即對(duì)照)組12例、中藥復(fù)方聯(lián)合西藥即試驗(yàn)組22例；臨床診斷根據(jù)臨床癥狀、體征、X線胸片、CT掃描、痰菌檢查，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有納入研究對(duì)象均無(wú)心、肝、腎等臟器合并癥及其他感染，無(wú)糖尿病、自身免疫相關(guān)性或免疫性疾病，3個(gè)月內(nèi)未用過(guò)免疫抑制劑及激素等藥物。納入研究對(duì)象簽署知情同意書，按臨床試驗(yàn)方案分別標(biāo)準(zhǔn)化療(西藥)即對(duì)照組、西藥+中藥復(fù)方進(jìn)行抗結(jié)核治療即試驗(yàn)組，第0、3、6、9個(gè)月時(shí)分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血。

1.2 儀器與試劑 采用Beckman-Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀，流CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE、IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE、溶血?jiǎng)㎡ptiLyse C 均購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司。復(fù)方中藥“益肺通絡(luò)方”顆粒為本院自制顆粒劑。

1.3 方法 取2 mL靜脈血、肝素抗凝，混勻，各取50 μL全血于3支測(cè)定管，第l管加入IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE，第2管加入CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE單克隆抗體量均為20 μL，標(biāo)記抗體和抗凝血混勻后，在室溫、避光15 min后，每管400 μL溶血?jiǎng)㎡ptiLyse C溶解紅細(xì)胞1 h，用側(cè)向散射光(SS)和前向散射光(Fs)圈門選取淋巴細(xì)胞群，以IgGl-FITC/IgGl-PE/IgGl-PC5為Treg細(xì)胞同型對(duì)照。分別檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分比含量。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的各指標(biāo)水平比較 對(duì)照組，第0、3、6、9個(gè)月時(shí)分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨抗結(jié)核治療時(shí)間推移Treg細(xì)胞數(shù)量逐漸下調(diào)，當(dāng)月(未抗結(jié)核治療)MDR-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(10.01±4.40)%，高于第3個(gè)月的(9.03±3.50)%，第6個(gè)月的(8.33±3.39)%，第9個(gè)月的(7.10±3.74)%，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.313,P=0.230)。

2.2 試驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)水平比較 試驗(yàn)組，第0、3、6、9個(gè)月分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨抗結(jié)核治療時(shí)間推移Treg細(xì)胞數(shù)量逐漸下調(diào)，當(dāng)月(未抗結(jié)核治療)，MDR-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(10.85±5.66)%，高于第3個(gè)月的(7.12±3.80)%，第6個(gè)月的(4.88±2.57)%，第9個(gè)月的(3.41±1.53)%，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.317,P=0.007)。

2.3 2組結(jié)核患者不同時(shí)間點(diǎn)的外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平比較 抗結(jié)核治療不同時(shí)間點(diǎn)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分含量變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.361,P=0.018)，對(duì)照組Treg細(xì)胞數(shù)量變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.313P=0.230)；試驗(yàn)組隨著抗結(jié)核治療時(shí)間推移Treg細(xì)胞數(shù)量逐漸下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.317,P=0.007)。2組組間比較，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分含量變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.207,P=0.047)，分組與各時(shí)間點(diǎn)無(wú)交互效應(yīng)(F=3.504,P=0.094)。見表1。

表1 抗結(jié)核治療前后不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比±s，%)

注：組內(nèi)比較F=6.361，P=0.018；組間比較F=5.207，P=0.047。

3 討 論

近年中草藥在抗結(jié)核分枝桿菌、增強(qiáng)和(或)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、輔助治療結(jié)核病、減輕藥物的不良反應(yīng)和對(duì)機(jī)體生理功能影響等方面已有一些研究[5-7]。復(fù)方中藥“益肺通絡(luò)方”顆粒為本院自制的專利配方顆粒劑，本院采用復(fù)方中藥“益肺通絡(luò)方”顆粒干預(yù)多耐藥結(jié)核病患者，取得了較好的臨床療效。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+CD127lowTreg與多種腫瘤以及慢性感染免疫抑制狀態(tài)有關(guān)。Treg細(xì)胞通過(guò)分泌抑制性的細(xì)胞因子、細(xì)胞接觸和誘導(dǎo)凋亡等方式發(fā)揮其免疫抑制的功能，進(jìn)而間接抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞特異性免疫[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，外科切除治療空洞型多耐藥肺結(jié)核后，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，表明Treg細(xì)胞參與了多耐藥肺結(jié)核疾病進(jìn)程[10]。本研究選取20例多耐藥結(jié)核病患者，按臨床試驗(yàn)方案隨機(jī)分標(biāo)準(zhǔn)化療(西藥)組與中藥復(fù)方聯(lián)合西藥組，在第0、3、6、9個(gè)月時(shí)分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血，流式細(xì)胞檢測(cè)T淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨服藥時(shí)間推移，對(duì)照組MDR-TB患者外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比數(shù)量各月份略有下降；而試驗(yàn)組MDR-TB患者外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比數(shù)量下降明顯，2組間的CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分比變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.207,P=0.047)，表明中藥復(fù)方聯(lián)合西藥治療耐藥結(jié)核在下調(diào)免疫抑制細(xì)胞CD4+CD25+CD127lowTreg有較好的效果。同時(shí)，提示復(fù)方中藥“益肺通絡(luò)方”顆?？赡軈f(xié)同西藥打破MDR-TB組患者CD4+CD25+CD127lowTreg產(chǎn)生的免疫抑制。

綜上所述，復(fù)方中藥“益肺通絡(luò)方”可能協(xié)同西藥下調(diào)CD4+CD25+CD127lowTreg免疫抑制，提升報(bào)道。多耐藥結(jié)核病特異性的細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗結(jié)核免疫調(diào)節(jié)作用。誠(chéng)然，深入研究復(fù)方中藥在多耐藥結(jié)核病中的免疫調(diào)節(jié)作用或許是對(duì)抗耐藥結(jié)核治療是一個(gè)有益的幫助。

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Significance of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in therapy of anti-MDR-TB*

FANRen-hua,XIANGYan-gen△,YANGLi△,LIUYan-ke,YINKe,FENGWen-jun,XUYi-xin,XieHe-bin,FUMan-jiao,WUJia-ling,WANGLei,ZHANGTing

(ChangshaCentralHospital,Changsha,Hunan410004,China)

Objective To investigate the immunomodulatory role of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in Western medicine combined with Chinese medicine Compound Yifeitongluo Decoction for treating multi-drug resistant pulmonary tuberculosis.Methods 34 cases of multidrug-resistant TB (MDR-TB) were selected and randomly divided into the standard chemotherapy(Western medicine) group (12 cases,control group) and the Western medicine plus compound Chinese medicine group(22 cases,experimental group).The informed consent was obtained from all subjects and the anti-TB therapy was performed according to the clinical trial scheme.2mL of heparin coagulated peripheral venous blood was collected in 0,3,6,9 months.After CD4,CD25 and CD127 monoclonal antibody labeling,the percentage of CD4+CD25+CD127lowin each group was detected by using the Beckman flow cytometry (FCM).Results The percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in control group was declined with time lapse,but without statistical significance (P>0.05);which in the experimental group was decreased significantly (P=0.007);compared with the control group,the percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in the experimental group was decreased significantly (P=0.047).Conclusion After 9-month anti-TB therapy,the experimental group can effectively decrease the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells.The compound Chinese medicine could synergize the Western medicine to down-regulate the immunosuppression of regulatory T cells and recover the body immune balance of TB patients.Therefore,compound Chinese medicine combined with Western medicine may be a beneficial help to the anti-MDR-TB therapy.

CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells； multi-drug resistant pulmonary tuberculosis； anti-tuberculosis therapy

艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)2013年立項(xiàng)項(xiàng)目(2013ZX10005004)。

范任華，男，主管技師，博士，主要從事肺結(jié)核免疫調(diào)節(jié)方面的研究。

△通訊作者，E-mail:yanglicszxyy@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.004

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1672-9455(2015)16-2307-02

2015-02-10

2015-04-20)