袁若愚，季伙燕，王建新，孟舒婷，王惠民,2Δ(.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 22600； 2.南通大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通 22600)

?

·論 著·

乳酸脫氫酶催化活性濃度測量的不確定度評定*

袁若愚1，季伙燕1，王建新1，孟舒婷1，王惠民1,2Δ(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通 226001)

目的 評定在乳酸脫氫酶(LDH)催化活性濃度測量中不同廠家或批號試劑的不確定度。方法 配制不同廠家或批號LDH試劑，用國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)參考方法分別檢測中值和高值兩個濃度的混合血清，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗，計算不同廠家或批號試劑間的不確定度。結(jié)果P<0.05表示對不同廠家或批號LDH試劑，所測LDH催化活性濃度結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同試劑批號對中值和高值混合血清的擴展不確定度U分別為6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。結(jié)論 不同廠家或批號試劑對LDH催化活性測量有影響，因此，在進(jìn)行不確定度評定時，應(yīng)考慮不同廠家或批號試劑的影響。

LDH催化活性濃度； 乳酸鋰鹽； N-甲基-D-葡糖胺； 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)推薦的乳酸脫氫酶(LDH)催化活性濃度測量方法為手工法，其所需試劑原材料為乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD二水合鋰鹽，但未規(guī)定所使用各試劑的生產(chǎn)廠家及批號。每年參加國際參考實驗室間質(zhì)量評價(RELA計劃)的國內(nèi)外參考實驗室或候選參考實驗室達(dá)數(shù)十家，各參考實驗室均使用IFCC推薦的參考方法，但對相同樣本中LDH催化活性濃度的測量結(jié)果仍存在差異[1-2]。本實驗比較不同廠家或批號試劑對LDH催化活性濃度的影響，評估其不確定度，作為實驗室評估測量結(jié)果不確定度時的參考[3-4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)導(dǎo)則34，選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院中、高2種濃度LDH混合血清(中值濃度范圍為100～235 U/L，高值濃度范圍為360～800 U/L)，先后采用0.45 μm孔徑和0.22 μm孔徑的醋酸纖維素濾菌膜過濾分裝，置-70 ℃保存[5-6]。

1.2 儀器與試劑 儀器：日本日立公司U-3310紫外-可見分光光度計；意大利Hanna公司HI98183型pH計；美國Fluke公司1521點式溫度計；德國SartoriusBT25S電子天平；德國Eppendorf reference移液器；北京格瑞恩公司DKB-501A型超級恒溫水槽。分光光度計、天平、pH計、溫度計和移液器均由南通市計量檢定測試所檢定，分光光度計、天平、pH計使用前均進(jìn)行校正。試劑：乳酸鋰鹽分別購自Sigma公司(批號1為SLBC8966V，批號2為060M5441)、蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司(YK2014010801)、日本東京化成工業(yè)株式會社(TCIWTTCL-LL)、國藥集團化學(xué)試劑有限公司(批號1為T20100310，批號2為T20110104)、德國Applichem公司(8R004802)。N-甲基-D-葡糖胺分別購自Sigma公司(批號1為SLBD8581V，批號2為SLBD4908V)、阿拉丁試劑(中國)有限公司(34759)、日本東京化成工業(yè)株式會社(批號1為34GFKPB，批號2為A877EHL)。NAD分別購自Sigma公司(021M7015V)、國藥集團化學(xué)試劑有限公司(20131121)、阿拉丁試劑(中國)有限公司(39720)、美國Amresco公司(批號1為0090C423，批號2為1071C303)。NAD二合水鋰鹽購自Sigma公司(SLBB8328V)。

1.3 方法 應(yīng)用IFCC參考測量程序，在日立U-3310紫外-可見分光光度計的反應(yīng)杯內(nèi)加入2.000 mL反應(yīng)液和0.100 mL混合血清標(biāo)本，完全混合并孵育180 s，在180 s末加入0.200 mL的起始反應(yīng)液，延滯90 s，測量180 s內(nèi)吸光度變化率，計算LDH催化活性[7]。用參考方法對上述收集的中值和高值混合血清分別進(jìn)行測定，每個廠家或批號試劑分別測量中值和高值混合血清各5次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對t檢驗分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同廠家或批號試劑間的不確定度的計算參照下列公式進(jìn)行。

擴展不確定度 U=k·uc

2 結(jié) 果

2.1 不同廠家或批號試劑測定LDH活性統(tǒng)計結(jié)果比較 不同廠家或批號乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺與NAD測定LDH催化活性濃度值統(tǒng)計結(jié)果見表1。

2.2 不同廠家或批號試劑配對t檢驗分析 為了判斷各廠家或批號試劑對LDH催化活性濃度的影響是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，采用SPSS19.0軟件對上述結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，測定LDH催化活性濃度的乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺與NAD廠家或批號的兩兩比較結(jié)果見表2。

表1 不同廠家或批號試劑測定LDH活性統(tǒng)計結(jié)果比較

2.3 不同廠家或批號試劑間的不確定度評定結(jié)果 根據(jù)貝塞爾公式，分別計算不同廠家或批號乳酸鋰鹽的不確定度結(jié)果為u(中值) 3.34 U/L和u(高值) 8.93 U/L，相對不確定度結(jié)果為urel(中值) 1.91%和urel(高值) 1.69%；不同廠家或批號N-甲基-D-葡糖胺的不確定度結(jié)果為u(中值) 2.26 U/L和u(高值) 9.30 U/L，相對不確定度結(jié)果為urel(中值) 1.29%和urel(高值) 1.78%；不同廠家或批號NAD的不確定度結(jié)果為u(中值) 4.02 U/L和u(高值) 12.28 U/L，相對不確定度結(jié)果為urel(中值) 2.31%和urel(高值) 2.35%。根據(jù)以上所得的相對不確定度，計算不同廠家或批號的LDH試劑對中值和高值混合血清的合成不確定度和擴展不確定度。

中值：

高值：

表2 不同廠家或批號試劑配對t檢驗分析

3 討 論

目前國內(nèi)外有關(guān)評定在LDH催化活性濃度測量中不同廠家或批號試劑的不確定度方面的研究還較少。本研究比較不同廠家或批號試劑對LDH催化活性濃度的影響，結(jié)果表明對不同廠家或批號LDH試劑，所測LDH催化活性濃度結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。計算得到不同試劑批號對中值和高值混合血清的合成不確定度uc分別為3.26%和3.39%，擴展不確定度U為分別為6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。

本研究所得結(jié)果與德國臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)協(xié)會——參考實驗室2(DGKL-Rf2)所提供的試劑批號所引起的不確定度1.24%相比有所差異，可能是由于本實驗室所用的試劑廠家及批號與DGKL-Rf2所用的不同所引起的。所以，本研究在評定不同廠家或批號試劑對LDH催化活性濃度所引起的不確定度時，應(yīng)結(jié)合自身實驗室的實際情況，不宜直接引用其他參考實驗室的數(shù)據(jù)。

因此，在進(jìn)行不確定度評定時，應(yīng)考慮不同廠家批號試劑對其的影響；在進(jìn)行校準(zhǔn)和測量能力的評定時，也應(yīng)考慮不同試劑廠家批號的影響。在今后工作中可以增加不同試劑廠家或批號數(shù)目，同時測量多個酶的催化活性濃度，進(jìn)行長期研究，積累更多的數(shù)據(jù)，為參考實驗室評估測量結(jié)果不確定度時提供參考[9]。

[1]遲珊,沈默,張曼.谷氨?；D(zhuǎn)移酶國際室間比對計劃結(jié)果分析[J].檢驗醫(yī)學(xué),2011,26(8):540-543.

[2]楊振華.建設(shè)我國檢驗醫(yī)學(xué)參考體系任重道遠(yuǎn)[J].臨床檢驗雜志，2012,30(10):734-736.

[3]Mauris G,Lasserre V,Foulloy L. A fuzzy approach for the expression of uncertainty in measurement[J].Measurement,2001,29(3):165-177.

[4]陳寶榮,孫慧穎,邵燕,等.基于“實驗設(shè)計”的臨床酶學(xué)參考方法測量不確定度評價模型的建立[J].臨床檢驗雜志,2011,29(5):327-330．

[5]Westwood S,King B,Noble B.Implementation of ISO Guide 34:Accreditation for reference material production.Accredit Qual Assur,2003,8(9):424-427.

[6]沈蕾,王建新,季伙燕,等.常規(guī)法測定不同GGT催化活性的不確定度評定[J].臨床檢驗雜志，2011,29(9):650-652.

[7]Schumann G,Bonora R,Ceriotti F,et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 3.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase[J].Clin Chem Lab Med，2002,40(6):643-648.

[8]BIPM,IEC,IFCC,ISO,IUPAC,IUPAP,OIML.Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)[M]．1st ed．Switzerland:International Organization for Standardization，2008:1-7．

[9]汪靜,張傳寶,居漪,等.國際臨床化學(xué)聯(lián)合會酶學(xué)測定參考方法實驗室網(wǎng)絡(luò)的初步建立[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2008,31(3):258-263.

Estimation on measurement uncertainty of lactate dehydrogenase catalytic activity concentration*

YUANRuo-yu1,JIHuo-yan1,WANGJian-xin1,MENGShu-ting1,WANGHui-min1,2△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine，HospitalAffiliatedtoNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China;2.InstituteofLaboratoryMedicine，NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To evaluate the measurement uncertainty of lactate dehydrogenase(LDH) catalytic activity concentration with different manufacturers or different lot numbers.Methods The LDH reagents with different manufacturers or different lot numbers were prepared.The pooled serum with low or high concentrations was measured by the reference method recommended by International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine(IFCC)．The experimental data were analyzed by paired t test.The measurement uncertainty of lactate dehydrogenase with different manufacturers or different lot numbers was calculated.ResultsP<0.05 indicated that the differences of detected LDH catalytic activity concentrations results for different manufacturers or lot numbers of LDH reagents had statistical significance.The expanded uncertainty (U) of different manufacturers or lot numbers of reagents were 6.52%(k=2) for low concentration and 6.78%(k=2) for high concentration.Conclusion Different manufacturers or different lot numbers of reagents have significant effect on the catalytic activity concentrations of LDH.Therefore,in the detection of measurement uncertainty,the impact of different manufacturers or different lot numbers of reagents should be considered.

LDH catalytic activity concentrations; lithium lactate; N-methyl-D-glucamine； nicotinamide adenine dinucleotide

國家質(zhì)檢總局科研項目(201210066);南通市科技項目(HS2012009)。

袁若愚，女，在讀碩士，主要從事生物化學(xué)及酶學(xué)檢驗方面的研究?！?/p>

，E-mail:whm_jyk@ntu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.003

A

1672-9455(2015)16-2304-03

2015-02-25

2015-04-20)