馮曉娟 范志亮 康聚賢 豆真珍 范志剛 尹少華

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054001)

河北漢族人群CYP1A2 C163A基因多態(tài)性研究*

馮曉娟 范志亮 康聚賢 豆真珍 范志剛 尹少華

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054001)

目的 探討河北漢族人群細(xì)胞色素P450 1A2(cytochrome P450 1A2，CYP1A2)C163A基因多態(tài)性的分布情況。方法 應(yīng)用聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) 方法對(duì)210例河北漢族正常人進(jìn)行CYP1A2 C163A基因多態(tài)性分析。結(jié)果 河北漢族人群CYP1A2 C163A基因A和C等位基因的頻率為：68.3%、31.7%。AA、AC、CC基因型頻率分別為48.1%、40.5%、11.4%。符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(χ2=1.22，P>0.05)，具有代表性。結(jié)論 河北漢族人群CYP1A2基因存在 C163A位點(diǎn)多態(tài)性。

細(xì)胞色素P450 1A2；基因；多態(tài)性

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)，是一類在內(nèi)源性化合物，在藥物的代謝中起關(guān)鍵作用[1]。細(xì)胞色素P450由一類功能和結(jié)構(gòu)類似的酶組成，屬于超家族酶系，其編碼基因存在多態(tài)性。這種多態(tài)性在很大程度上會(huì)影響個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)和不良反應(yīng)[2]。細(xì)胞色素P450 1A2(CYP1A2)屬于該家族成員之一，在臨床常用藥物的代謝以及前致癌物質(zhì)激活或滅活過程中起著重要的作用。研究表明CYP1A2具有遺傳多態(tài)性，并且存在種族和區(qū)域的差異[3]。本文探討CYP1A2 C163A基因多態(tài)性在河北健康漢族人群中的分布，為以后其與多種疾病相關(guān)性、藥物代謝研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 受試對(duì)象

為210例無直接血緣關(guān)系的健康河北省漢族個(gè)體，且符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1)漢族，祖籍河北；2)無任何遺傳傾向性疾?。?)在取樣當(dāng)時(shí)均未診斷有各種腫瘤、心腦血管病、精神異常及其他重大健康問題。其中男性為121例，女性為89例。平均年齡為(42.27±9.31)歲(23～71歲)。本試驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)討論通過，受試者簽署知情同意書。

1.2 試驗(yàn)方法

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) 方法研究分析CYP1A2 C163A的基因多態(tài)性。

1.2.1 DNA的提取 血液樣品DNA通過北京天根公司的血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。步驟如下：1)將-80 ℃凍存的抗凝血混勻，取300μL放入1.5ml離心管中，加入750μL的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻5次；2)10000g離心1min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2min；3)向此管中加入緩沖液FG和蛋白酶K的混合液151.5μL，立即漩渦至溶液無團(tuán)塊；56 ℃水浴10min，其間顛倒混勻數(shù)次；4)加入異丙醇150μL，顛倒混勻，10000g離心3min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2min；5)加入70%乙醇150μL，漩渦振蕩5s，10000g離心3min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留5min，空氣干燥5min；6)加入洗脫緩沖液TB 200μL，低速漩渦5s，65℃水浴1h，其間顛倒混勻數(shù)次助溶。最后保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]1)設(shè)計(jì)引物(由上海生物工程技術(shù)有限公司合成):上游引物為：5'-CTACTCCAGCCCCAGAAGTG'-3'；下游引物為：5'-GAAGGGAACAGACTGGGACA-3'。2)PCR擴(kuò)增體系:總體積20μL，體系終濃度:1 ×PCR 緩沖液，0.2 mmol/ L dNTP，引物各300pmol/ L，模板DNA(25～50ng)，TaqDNA 聚合酶0.5U。3)PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5min，95℃變性30s，58℃退火50s，72 ℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 取5μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加樣于3%瓊脂糖(1μL的Goldview I型核酸染色劑)上，100V電壓條件下，電泳40min，之后用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，目的條帶于318bp處顯影。

1.2.4 限制性片段長度多態(tài)性分析 酶切反應(yīng)總體積為20μL，含10μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物、10U的限制性核酸內(nèi)切酶Bsp120I、2μL 10 ×buffer、7.6μL的超純?nèi)ルx子水。以雙蒸水代酶作為陰性對(duì)照，37 ℃酶切16h。取酶切產(chǎn)物5μL，加樣于3 %瓊脂糖凝膠上，100V電壓電泳40min，再用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 CYP1A2 C163A基因酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bsp120I酶酶切以后，電泳可見到318bp一條條帶，即為AA基因型；若酶切后，產(chǎn)生193bp、125bp 2條條帶，即為CC基因型；若酶切后，產(chǎn)生318bp、193bp、125bp 3條條帶，即為AC基因型。隨機(jī)從每種基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中選取3個(gè)，進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，其結(jié)果均與本試驗(yàn)相同。見圖1。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；3、5：AA基因型；1、2：AC基因型；4：CC基因型。

2.2 CYP1A2 C163A基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)

經(jīng)檢驗(yàn)，河北漢族人群CYP1A2 C163A基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，結(jié)果見表1。

表1 CYP1A2 C163A基因型及基因頻數(shù)(n，%)

3 討論

細(xì)胞色素P450是存在肝臟當(dāng)中參與藥物、維生素、類固醇、脂類代謝的一類酶。遺傳、環(huán)境等因素都可造成CYP基因變異， 引起其編碼的酶活性變化，從而影響體內(nèi)由它催化的許多代謝和反應(yīng)，使其發(fā)生明顯的差異，因此，CYP基因多態(tài)性是造成個(gè)體藥物代謝差異的基礎(chǔ)[5]。CYP1A2是細(xì)胞色素P450超家族的成員。其基因位于第15 號(hào)染色體上，全長約7.8 kb，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。

目前研究發(fā)現(xiàn)，CYP1A2 至少存在14 種單核苷酸多態(tài)，其中研究較多是CYP1A2*1C、CYP1A2*1D、CYP1A2*1E和CYP1A2*1F[6-7]。CYP1A2*1F等位基因在內(nèi)含子1中存在一個(gè)C163A突變，即CYP1A2 C163A 多態(tài)性。CYP1A2 C163A 多態(tài)性可能會(huì)影響基因的表達(dá)和藥物在體內(nèi)的代謝[2]。CYP1A2 C163A 多態(tài)性與抗精神病藥物的副作用反應(yīng)有關(guān)[8]。趙龍等[6]研究表明：CYP1A2 C163A多態(tài)性可能與COPD遺傳易感性增加有關(guān)。

本文對(duì)210例河北健康漢族人群血樣標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)河北漢族人群CYP1A2 C163A基因A和C等位基因的頻率為：68.3%、31.7%。AA、AC、CC基因型頻率分別為48.1%、40.5%、11.4%。河北漢族人群CYP1A2 C163A基因存在多態(tài)性，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(χ2=1.22，P>0.05)。與中國其他地區(qū)的研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)河北地區(qū)與沈陽、包頭漢族人群在CYP1A2 C163A基因型和等位基因分布上的差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。韓慶梅等[9]研究發(fā)現(xiàn)漢族A等位基因頻率為64%，與本文結(jié)果十分接近。與國外的研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)河北地區(qū)漢族人群與法國、美國人群在CYPIA2 C163A基因型和等位基因分布頻率上十分相近，與印度人群存在顯著差異[10-12]。雖然印度與中國同處于亞洲，但漢族人與印度人人種明顯不同，且印度人為多民族國家，基因的這種差別，應(yīng)慮由人種、民族和區(qū)域環(huán)境不同所致，當(dāng)然，這需要進(jìn)一步大樣本、多中心研究以證實(shí)。

總之，我們發(fā)現(xiàn)河北漢族人群CYP1A2 C163A基因存在多態(tài)性，這可以為人群遺傳學(xué)提供依據(jù)，為臨床個(gè)體藥物治療起一定指導(dǎo)作用，為以后進(jìn)一步的疾病相關(guān)性研究打下基礎(chǔ)。

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本刊編輯部

Genetic polymorphism of CYP1A2 C163A in Chinese Han Population in Hebei province

FENGXiaojuan，F(xiàn)ANZhiliang，KANGJuxian，DOUZhenzhen，F(xiàn)ANZhigang，YINShaohua

(Xingtai People's Hospital Affiliated of Hebei Medical University，Xingtai 054001，China)

ObjectiveTo identify the gene polymorphisms of CYP1A2 C163A in Chinese Han Population in Hebei province.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism ( PCR-RFLP) was used to detect the genotype of CYP1A2 C163A in 210 Chinese Han people in Hebei province.ResultsThe frequency of A and C alleles were 68.3% and 31.7% respectively.The frequency of each genotype was 48.1% ( AA),40.5% ( AC),11.4% ( CC).The genotype distribution of the Chinese Han Population in Hebei province coincided with Hardy-Weinberg equilibrium(χ2=1.22，P>0.05).ConclusionC163A locus polymorphism of the CYP1A2 gene is present in Han Population in Hebei province.

Cytochrome P-450 1A2;Gene;Polymorphism.

* [基金項(xiàng)目]河北省邢臺(tái)市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013ZC171)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.02.007

R394.5

A

1000-9760(2015)04-103-03

2015-03-15)