李 楊，趙 鵬，蘇 春，陳建立，劉 洋，張國(guó)志

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000)

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·論 著·

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠重癥急性胰腺炎肝損傷的臨床意義

李 楊，趙 鵬，蘇 春，陳建立，劉 洋，張國(guó)志△

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000)

目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)，是否參與大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。方法 采用5%?；悄懰徕c建立大鼠SAP肝損傷模型，將80只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，假手術(shù)組(sham組)及模型組，各40只，每組又按時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為3、6、12、24、36 h 5個(gè)組。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的含量變化，HE染色觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化，免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)大鼠肝臟組織GRP78及CHOP的表達(dá)水平。結(jié)果 (1)模型組血清AMY、ALT及AST水平逐漸升高，且12 h達(dá)到峰值(P<0.05)；模型組比對(duì)應(yīng)的Sham組血清酶水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)HE染色結(jié)果顯示，肝臟在24 h時(shí)損傷最嚴(yán)重。(3)模型組GRP78及CHOP表達(dá)水平逐漸增加，且以24 h表達(dá)水平最高(P<0.05)；模型組比對(duì)應(yīng)的sham組GRP78及CHOP表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SAP肝損傷發(fā)病中24 h最嚴(yán)重，GRP78及CHOP表達(dá)明顯增加，其可能參與SAP肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白； 重癥急性胰腺炎； 肝損傷

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見(jiàn)急腹癥之一，其病情兇險(xiǎn)，病死率高，大多數(shù)SAP患者在胰腺出血、壞死的同時(shí)，伴有心、肝、肺、腎、胃、腸等器官損傷。其中，肝臟損傷在胰腺外器官損傷中發(fā)病率甚高，達(dá)88.9%。SAP并發(fā)肝損傷不但可以加重胰腺炎病情，而且容易引起多器官功能障礙,導(dǎo)致患者病死，病死率高達(dá)30%～40%[1]。眾多研究表明，SAP發(fā)病機(jī)制可能與炎性介質(zhì)、氧自由基、線粒體應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。目前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是肝損傷發(fā)生過(guò)程中較重要的因子。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是指在各種不良情況下被破壞，功能發(fā)生紊亂，使大量錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)累積及鈣平衡紊亂的過(guò)程。當(dāng)ERS時(shí)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)可以啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[2]，UPR具有增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白折疊和降解的功能，并下調(diào)蛋白合成能力，減輕各種應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境而生存；但在持續(xù)而又嚴(yán)重的ERS過(guò)程中，UPR將不足以抵抗ERS，從而刺激細(xì)胞產(chǎn)生一系列促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-12，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。近年來(lái)，關(guān)于ERS與各種因素造成的肝損傷的關(guān)系已有了一些研究報(bào)道，但SAP肝損傷與ERS的研究甚少。現(xiàn)探討SAP并發(fā)肝損傷過(guò)程中ERS是否參與。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量250～280 g(河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和模型組，各40只，各組又按時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為3、6、12、24、36 h 5個(gè)組，每組各8只。

1.2 動(dòng)物模型 術(shù)前12 h 禁食，自由飲水，采用10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g行腹腔內(nèi)注射麻醉、固定。經(jīng)上腹正中切口入腹,提起十二指腸及胰腺，沿胰膽管方向，尋找十二指腸大乳頭開(kāi)口位置，于其開(kāi)口略偏下對(duì)系膜緣腸壁上選一無(wú)血管區(qū)，使用24號(hào)一次性靜脈留置針進(jìn)針，進(jìn)入腸腔后拔出針頭3～5 mm，然后使導(dǎo)管前端貼系膜緣腸壁向乳頭開(kāi)口方向緩慢滑行，探入胰膽管內(nèi)，順其推進(jìn) 5～7 mm 后，應(yīng)用微型動(dòng)脈夾分別夾閉十二指腸大乳頭開(kāi)口及胰膽管肝門(mén)端。然后注射3%牛黃膽酸鈉1 mL/100 g，持續(xù)10 s，停留3 min,去除動(dòng)脈夾，拔出留置針，分層縫合腹壁，造模成功，術(shù)后大鼠自由飲食、飲水。sham組僅打開(kāi)腹腔，翻動(dòng)胰腺組織后關(guān)腹。

1.3 主要試劑 ?；悄懰徕c購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，水合氯醛購(gòu)于天津歐博凱化工有限公司，CHOP、BiP Antibody購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，β-Tublin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、抗鼠IgG、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Beyo ECL Plus均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，顯影劑D-72、定影劑D-72購(gòu)于天津市世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司。

1.4 血清酶檢測(cè) 模型組及sham組分別于術(shù)后第3、6、12、24、36 h 再次麻醉,經(jīng)原切口入腹，使用采血針從下腔靜脈采血3.5 mL,應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平變化。

1.5 HE染色 各組大鼠采血后，分別取部分肝組織于4%多聚甲醛溶液中固定，取部分肝組織凍存。4%多聚甲醛溶液固定的肝組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡下觀察各時(shí)間點(diǎn)肝臟組織的病理學(xué)改變。

1.6 免疫印跡法(Western Blot) 將凍存肝組織研磨，加入組織裂解液(100 μL/100 mg)裂解蛋白，然后高速離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，留取上清液。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明檢測(cè)樣品蛋白濃度，計(jì)算上樣量。采用SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移,10%脫脂奶粉封閉，加1抗，4 ℃搖床過(guò)夜?；厥?抗，PBS洗膜3次，10分鐘/次，加入相應(yīng)2抗孵1.5 h，回收2抗，PBS洗膜3次，10分鐘/次。然后按照Beyo ECL Plus說(shuō)明顯色，X光線膠片曝光。以β-Tublin孵育作為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清酶學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 模型組大鼠血清AMY、ALT及AST水平在建模成功后逐漸升高，于12 h達(dá)到峰值(P<0.05)，然后下降；模型組比相對(duì)應(yīng)的sham組血清酶水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；sham組各時(shí)間點(diǎn)之間的血清酶水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 sham各組肝臟病理學(xué)無(wú)明顯變化，鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞大小形態(tài)正常，肝竇無(wú)擴(kuò)張、淤血，肝小葉無(wú)水腫、壞死，匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；3、6 h可見(jiàn)肝細(xì)胞輕度水腫，肝竇略擴(kuò)張；12 h可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫加重，胞漿呈顆粒狀，肝竇擴(kuò)張、淤血；24 h肝細(xì)胞水腫進(jìn)一步加重，出現(xiàn)氣球樣變，肝竇明顯擴(kuò)張、淤血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且出現(xiàn)點(diǎn)狀或灶狀壞死；36 h時(shí)可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫減輕，肝竇擴(kuò)張、淤血有所減輕。提示SAP并發(fā)肝損傷于24 h損傷最嚴(yán)重。見(jiàn)圖1。

2.3 SAP肝損傷后GRP78、CHOP的含量變化 模型各組GRP78及CHOP的表達(dá)水平逐漸增多，且以24 h表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型各組比相對(duì)應(yīng)的sham各組GRP78及CHOP表達(dá)水平明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組6、12、24、36 h比相對(duì)應(yīng)的sham各組CHOP的表達(dá)水平明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。sham各組之間GRP78及CHOP表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 各模型組大鼠肝臟組織病理變化(HE，×400)

檢測(cè)項(xiàng)目3h6h12h24h36hAMY(模型組)1067．6±123．62299．5±333．35400．5±349．94757．0±320．83538．9±329．8AMY(sham組)645．0±84．5654．5±80．2656．4±78．1650．0±88．5650．1±82．0ALT(模型組)112．6±11．8275．1±19．4405．1±11．0317．9±12．3213．9±13．5ALT(sham組)44．3±3．646．6±3．646．9±3．146．6±3．744．5±2．9AST(模型組)224．6±22．7436．0±35．4634．8±32．5451．0±34．3394．3±33．3AST(sham組)126．0±13．3126．3±11．5128．0±12．2127．0±12．1125．6±13．6

圖2 各組大鼠GRP78及CHOP的表達(dá)情況

3 討 論

本組血清酶檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著SAP病情的發(fā)展，血清AMY、ALT及AST逐漸升高，于12 h達(dá)到高峰，之后降低。肝組織病理學(xué)顯示，肝細(xì)胞逐漸水腫，發(fā)生氣球樣變，肝竇逐漸充血、淤血，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且肝局部出現(xiàn)點(diǎn)狀或片狀壞死，于24 h最嚴(yán)重，然后有所好轉(zhuǎn)。提示本組成功制造SAP肝損傷的模型。

UPR通路是ERS激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的一條通路，其主要由GRP78及肌醇酶1(IRE1)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)組成[4]。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，GRP78分別從IRE1、PERK、ATF6分離，從而使這3個(gè)ERS感受蛋白活化[5]?；罨腅RS感受蛋白一方面使GRP78表達(dá)增多，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)未折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白的處理能力[6]；另一方面使CHOP的表達(dá)上調(diào)，而CHOP高表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此當(dāng)過(guò)強(qiáng)或長(zhǎng)時(shí)間的ERS將可能會(huì)通過(guò)激活CHOP途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fu 等[7]研究表明，敲除CHOP基因可使細(xì)胞避免出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。說(shuō)明ERS可通過(guò)CHOP的高表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)蛋白水平研究表明，隨著SAP肝損傷病情的發(fā)展，ERS相關(guān)蛋白GRP78及CHOP的表達(dá)逐漸大量增加，于24 h達(dá)到高峰，之后有所降低。這與肝臟病理學(xué)結(jié)果一致，提示ERS可能通過(guò)GRP78及CHOP促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，參與SAP肝損傷的發(fā)生、發(fā)展。GRP78于24 h之后表達(dá)有所降低，可能是因?yàn)楫?dāng)CHOP表達(dá)到一定水平，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路對(duì)其具有抑制作用[8]；而CHOP表達(dá)減少可能是因?yàn)镃HOP進(jìn)一步與Tribbles同源蛋白3 (TRB3)基因上的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)TRB3表達(dá)，TRB3能夠通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制CHOP表達(dá)[9]。因此，本組推測(cè)GRP78的表達(dá)高峰可能在24 h之前，其具體的機(jī)制以及ERS其他相關(guān)蛋白在SAP肝損傷過(guò)程中的具體作用，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，SAP肝損傷于24 h損傷最嚴(yán)重；ERS可能參與SAP肝損傷的發(fā)生、發(fā)展。

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The funcation of endoplasmic reticulum stress in rat severe acute pancreatitis-associated liver injury

LIYang,ZHAOPeng,SUChun,CHENJian-li,LIUYang,ZHANGGuo-zhi△

(AffiliatedHospital,HebeiUnitedUniversity,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To observe the changes of endoplasmic reticulum stress-related molecules glucose-regulated protein 78 (GRP78) and CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein (CHOP) in the severe acute pancreatitis-associated liver injury and to discuss whether endoplasmic reticulum stress (ERS) participate in the progress of severe acute pancreatitis-associated liver injury.Methods The subject established the model of severe acute pancreatitis-associated liver injury by 5% sodium taurocholate.80 male SD rats were randomly divided into sham groups(n=40)and model groups(n=40).Then each groups were randomly divided into 3h,6h,12h,24h and 36h according time points.The changes of serum amylase (AMY),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were detected by automatic biochemical analyzer.Pathological changes of the liver were observed with HE staining.The expression of GRP78 and CHOP were detected by Western blot.Results (1)The level of serum enzyme were significantly increased and reached the peak value at 12h in model groups(P<0.05).The level of serum enzyme in the model groups were significantly increased compared with corresponding time points of sham groups (P<0.05).(2)The HE staining showed that the injury of the liver was the most serious at 24 h.(3)Western blot test showed that the expression of GRP78 and CHOP in the model groups were significantly increased and reached the peak value at 24 h(P<0.05).The expression of GRP78 and CHOP in the model groups were significantly increased compared with corresponding time points of sham groups(P<0.05).Conclusion The injury of the liver was the most serious at 24h and ERS may be involved in the progress of severe acute pancreatitis-associated liver injury.

endoplasmic reticulum stress； glucose-regulated protein 78； CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein； severe acute pancreatitis； liver injury

李楊，男，研究生，醫(yī)師，主要從事普通外科研究?！?/p>

，E-mail：qavipzhxp123@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.024

A

1672-9455(2015)12-1720-03

2014-12-22

2015-02-15)