吳 巍，段惠川，曹誼林

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海 200011)

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·論 著·

人毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)纖維連接蛋白鋪層最佳濃度的實(shí)驗(yàn)研究

吳 巍，段惠川，曹誼林△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海 200011)

目的 探討最適合人毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)及擴(kuò)增的纖維連接蛋白(FN)鋪層濃度。方法 將新鮮FN稀釋至所需要的4個(gè)濃度：5 μg/mL、200 ng/mL、10 ng/mL、0 ng/mL。使用酶消化法分離人毛囊細(xì)胞，將原代人毛囊干細(xì)胞在不同濃度鋪層的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞增值能力和克隆形成率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得最適合人毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)的鋪層濃度。結(jié)果 接種同一樣本相同數(shù)量細(xì)胞，做克隆效率測(cè)定，在原代培養(yǎng)第8天做Giemsa染色，結(jié)果顯示0 ng/cm2鋪層的培養(yǎng)皿中克隆團(tuán)小，數(shù)量少；10 ng/cm2鋪層的克隆團(tuán)大，數(shù)量多；200 ng/cm2和5 μg/cm2鋪層的克隆團(tuán)較小，數(shù)量不多。取10個(gè)樣本，分別對(duì)4個(gè)FN鋪層濃度的克隆效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，10 ng/cm2鋪層的克隆效率最高。在不同F(xiàn)N鋪層濃度條件下，細(xì)胞擴(kuò)增能力也不同，10 ng/cm2鋪層濃度細(xì)胞擴(kuò)增能力最強(qiáng)，與其他3個(gè)濃度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，200 ng/cm2與其余3個(gè)濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 10 ng/cm2的FN鋪層濃度效果最佳。

毛囊干細(xì)胞； 外根鞘； 組織工程； 纖維連接蛋白； 細(xì)胞培養(yǎng)

毛囊具有循環(huán)更新的能力，這種能力是由毛囊組織中的干細(xì)胞，即毛囊干細(xì)胞(HFSC)所產(chǎn)生[1]。有研究報(bào)道，毛囊干細(xì)胞不僅對(duì)于皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)有著再生和修復(fù)作用，還能在體外被誘導(dǎo)成骨、軟骨、脂肪、肌肉和神經(jīng)細(xì)胞，有望在未來(lái)被應(yīng)用于各類組織的修復(fù)[2-3]。但是毛囊干細(xì)胞，尤其是其在體外的培養(yǎng)和擴(kuò)增還無(wú)特別有效的方法；提高毛囊干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中干性(stemness)和增殖能力是其研究的基礎(chǔ)問(wèn)題。細(xì)胞體外貼壁培養(yǎng)，影響細(xì)胞增殖和生物學(xué)特性的2個(gè)主要因素：一是培養(yǎng)皿(板)的鋪層，二是培養(yǎng)液。以往的研究主要通過(guò)3T3細(xì)胞作為飼養(yǎng)層(鋪層)從而改善毛囊干細(xì)胞在體外的環(huán)境；但是作為小鼠來(lái)源的3T3細(xì)胞容易混入所飼養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞中，在未來(lái)人體應(yīng)用時(shí)帶來(lái)安全和倫理隱患。纖維連接蛋白(FN)是皮膚基底膜的主要成分之一，具有促進(jìn)多種細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)的作用，其對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用要強(qiáng)于Ⅳ型膠原和層粘連蛋白[4]。使用FN作細(xì)胞鋪層，從理論上可模擬體內(nèi)環(huán)境下細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸的狀態(tài)，為毛囊干細(xì)胞提供統(tǒng)一的類似生理狀態(tài)下的生長(zhǎng)環(huán)境，可能為一種有效的手段，避免3T3作為滋養(yǎng)層所帶來(lái)的倫理學(xué)問(wèn)題。因此，本研究旨在尋找最適合人毛囊干細(xì)胞黏附的FN鋪層濃度，這也是人毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)研究的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 (1)儀器：去離子水系統(tǒng) (Millipore,美國(guó))；恒溫CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific,美國(guó))；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國(guó))；離心機(jī)(Thermo,美國(guó))；微量精密天平秤(Startorius,德國(guó))；精密天平秤(Shangping,中國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)；熒光顯微鏡(Nikon,日本)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó))；冰箱(海爾，中國(guó))；24孔板(BD Falcon,美國(guó))；4孔板(BD Falcon,美國(guó))；6孔板(BD Falcon,美國(guó))； 10 cm 培養(yǎng)皿(BD Falcon,美國(guó))；15 mL離心管(BD Falcon,美國(guó))； 50 mL離心管(BD Falcon,美國(guó))； 0.22 μm針頭濾器 (Millipore,美國(guó))； 40 μm濾網(wǎng)(BD Falcon,美國(guó))；顯微外科手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠，中國(guó))；電動(dòng)移液器(Jencons，英國(guó))；Z2粒度計(jì)數(shù)儀(Beckman Coulter,美國(guó))。(2)試劑：Human Fibronectin(BD，美國(guó))；中性蛋白酶(Dispase，Roche,德國(guó))；胰蛋白酶、熒光封片劑(Gibco，美國(guó))；無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM，美國(guó))，添加表皮生長(zhǎng)因子和牛垂體添加物、F12培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；維生素、 L-谷氨酰胺(Sigma，美國(guó))；青霉素(上海新先鋒藥業(yè)有限公司，中國(guó))；鏈霉素(華北制藥股份有限公司，中國(guó))；腺嘌呤、氫化可的松、胰島素(Sigma，美國(guó))；各類抗體。

1.2 方法

1.2.1 FN的配制方法和實(shí)驗(yàn)分組 在無(wú)菌操作下，將FN粉末溶于PBS 中配制終濃度為100 μg/mL，共1 L，4 ℃保存，使用期限為1個(gè)月，每次鋪層時(shí)，新鮮FN稀釋至所需的4個(gè)濃度：5 μg/mL、200 ng/mL、10 ng/mL、0 ng/mL。

1.2.2 FN鋪盤 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入100 μL/cm2的FN溶液，搖晃培養(yǎng)皿至液體均勻鋪滿皿底；將培養(yǎng)皿放入4 ℃冰箱60 min或者過(guò)夜；負(fù)壓吸除FN溶液，置入37 ℃溫箱4～6 h，封口待用(1周內(nèi)使用)。

1.2.3 人毛囊外根鞘細(xì)胞的獲取與原代培養(yǎng) 手術(shù)(整形外科除皺手術(shù)或毛發(fā)移植術(shù))獲取的健康者頭皮樣本浸泡于添加雙抗的DMEM，4 ℃下保存不超過(guò)6 h。頭皮樣本采用氯霉素及PBS反復(fù)沖洗，在解剖顯微鏡下，剔除皮下脂肪組織，應(yīng)用手術(shù)刀將頭皮分剪成(0.25×0.25)cm2的小組織塊，加入用DMEM稀釋的12.5 mg/mL中性蛋白酶Ⅱ，4 ℃過(guò)夜；用顯微鑷子將表皮完整地去除，然后將完整的生長(zhǎng)期毛囊從真皮中拔出，使用PBS沖洗，以防止表皮細(xì)胞或真皮細(xì)胞的污染。為了得到毛囊單細(xì)胞懸液，將取下的毛囊用0.05% 胰酶+0.02%EDTA在 37 ℃下消化15 min，然后用含有10% FBS的DMEM液終止消化。反復(fù)吹打后，將細(xì)胞懸液通過(guò)40 μm濾網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液600 r/min離心5min，棄上清液，加入新鮮K-SFM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。按照1×104/cm2的接種密度將細(xì)胞種入無(wú)鋪層的6孔板中，放入含5% 二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 無(wú)滋養(yǎng)層無(wú)血清培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)人毛囊干細(xì)胞及其傳代擴(kuò)增 將消化所得的原代毛囊細(xì)胞按照1×104/cm2接種于事前鋪層好的4孔板中，采用無(wú)血清的角化上皮細(xì)胞培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到80%匯合時(shí)，以0.05% 胰酶消化細(xì)胞，37 ℃ 1～3 min，使用10% FBS終止消化，刮下細(xì)胞后收集細(xì)胞懸液離心(600 r/min，5 min)，棄上清液，加入新鮮K-SFM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。按照同樣的接種密度將細(xì)胞種入事前鋪層的培養(yǎng)皿中。放入含5% 二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照同樣方法傳代直至細(xì)胞停止擴(kuò)增為止。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 使用毛囊細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞混勻后，吸出10 μL用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3次取平均值。每次傳代時(shí)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.2.6 Giemsa染色 取Giemsa染料3.8 g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨，逐漸加甲醇至375 mL，溶解后再加125 mL 純甘油，于37 ℃溫箱保溫48 h；在此期間搖動(dòng)數(shù)次，放置1～2 周過(guò)濾，制成Giemsa儲(chǔ)存液(10×)。使用前，臨時(shí)配置Giemsa工作液：取1 mL 儲(chǔ)存液加入9 mL PBS，混勻后方可使用。吸干培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，加入4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min，吸除固定液后加入Giemsa工作液100 μL/cm2，室溫下靜置10～15 min后吸出工作液，PBS漂洗3～5次，晾干。

1.2.8 細(xì)胞增殖能力 將同一樣本的毛囊細(xì)胞原代按照1×104/cm2接種在不同F(xiàn)N濃度鋪層的培養(yǎng)皿中，K-SFM培養(yǎng)第8天時(shí)，用0.05%胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量(計(jì)數(shù)3次取平均值作為P0-D8的細(xì)胞數(shù))，通過(guò)公式分別計(jì)算出不同濃度FN鋪層的增殖能力。

1.2.9 免疫熒光鑒定 負(fù)壓吸除毛囊細(xì)胞培養(yǎng)液，加入37 ℃預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液，室溫固定10 min；PBS漂洗3次，每次3 min；10%羊血清(或兔血清)室溫封閉30 min；加入1抗4 ℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗3次，每次5 min；加入2抗，37 ℃孵育60 min；PBS漂洗3次，每次5 min；Hoechst 33342(1∶1 000)核襯染10 s或者DAPI(1∶500)核襯染10 s，PBS漂洗5 min 1次；熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察及拍攝照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)量為Z，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人毛囊干細(xì)胞的獲取與原代培養(yǎng) 經(jīng)酶消化后，所獲得的細(xì)胞接種于不同F(xiàn)N濃度鋪層的培養(yǎng)皿，20 min可見有部分細(xì)胞貼壁，大約在24 h后，大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，呈圓形，沒有伸展，在第2～3天，貼壁細(xì)胞逐漸伸展，絕大多數(shù)細(xì)胞最終形成鋪路石樣的細(xì)胞，細(xì)胞較小，呈圓形或多角形，核漿比例小，胞核圓，細(xì)胞形成小的克隆團(tuán)，但有極少量細(xì)胞呈橢圓形或梭形生長(zhǎng)，5～7 d迅速生長(zhǎng)成較大克隆團(tuán)。見圖1。

圖1 不同濃度FN鋪層對(duì)人毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

2.2 細(xì)胞克隆效率檢測(cè)4種不同濃度FN鋪層 接種同一樣本相同數(shù)量細(xì)胞，做克隆效率檢測(cè)，在原代培養(yǎng)第8天做Giemsa染色，結(jié)果顯示，0 ng/cm2的鋪層的培養(yǎng)皿中克隆團(tuán)小，數(shù)量少；10 ng/cm2鋪層的克隆團(tuán)大，數(shù)量多；200 ng/cm2和5 μg/cm2鋪層的克隆團(tuán)較小，數(shù)量不多。取10個(gè)樣本，分別對(duì)4個(gè)FN鋪層濃度的克隆效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，10 ng/cm2鋪層的克隆效率最高。見圖2。

2.3 不同F(xiàn)N 濃度對(duì)人毛囊干細(xì)胞擴(kuò)增能力的影響 在不同F(xiàn)N鋪層濃度條件下，細(xì)胞擴(kuò)增能力也不同，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析提示，10 ng/cm2鋪層濃度細(xì)胞擴(kuò)增能力最強(qiáng)，與其他3個(gè)濃度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，200 ng/cm2與其他3個(gè)濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 不同濃度FN鋪層對(duì)人毛囊干細(xì)胞克隆效率的影響

圖3 不同濃度FN鋪層對(duì)人毛囊干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響

3 討 論

為了滿足組織工程構(gòu)建等對(duì)種子細(xì)胞數(shù)量的要求，尋找一種可以促進(jìn)人毛囊細(xì)胞體外增殖但保持良好生物學(xué)性能的培養(yǎng)方法顯得十分重要。

以往的研究報(bào)道中較常用的是用抑制過(guò)的3T3細(xì)胞作滋養(yǎng)層、FAD作為培養(yǎng)基(其中添加很多細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法[5]。但是由于3T3是小鼠細(xì)胞，可能混入最終獲得的人毛囊干細(xì)胞，因此在倫理學(xué)和免疫排斥等方面都有不容忽視的問(wèn)題。而以人成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層要求成纖維細(xì)胞應(yīng)在有絲分裂的后期，其技術(shù)更不易掌控，很難為每次傳代提供非常標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的滋養(yǎng)層條件[6-7]。

本組前一部分研究采用無(wú)血清、無(wú)滋養(yǎng)層的培養(yǎng)方法，但發(fā)現(xiàn)在該種培養(yǎng)體系過(guò)程中，CK15、FST、CK19等人毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性O(shè)RS細(xì)胞會(huì)迅速減少，這可能是本組所采用的KSFM無(wú)血清培養(yǎng)基不能提供毛囊干細(xì)胞所需的體外生長(zhǎng)環(huán)境[8-10]。因此，本組使用改良該種培養(yǎng)方法，滿足人毛囊干細(xì)胞臨床應(yīng)用的需求。影響體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)有2個(gè)主要因素：一是培養(yǎng)皿(板)的鋪層，二是培養(yǎng)液。因此，本組首先采用對(duì)表皮類細(xì)胞黏附及增殖較為有效的FN來(lái)改善其鋪層。皮膚基底層主要由Ⅳ型膠原、FN、層粘連蛋白(laminin)等組成。其中FN作為皮膚基底膜的主要成分之一，能與細(xì)胞表面特異性受體以及細(xì)胞外基質(zhì)中其他大分子結(jié)合，對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附以及細(xì)胞外基質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的組建起重要作用[11]。FN是一種大型的糖蛋白，存在于所有脊椎動(dòng)物，分子含糖4.5%～9.5%，糖鏈結(jié)構(gòu)依組織細(xì)胞來(lái)源及分化狀態(tài)而異。FN可將細(xì)胞連接到細(xì)胞外基質(zhì)上。FN以可溶形式存在于血漿及各種體液中；以不溶形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞表面。前者總稱血漿FN；后者總稱細(xì)胞FN。每條FN肽鏈約含2 450個(gè)氨基酸殘基，整個(gè)肽鏈由3種類型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的模塊(module)重復(fù)排列構(gòu)成。具有5～7個(gè)有特定功能的結(jié)構(gòu)域，由蛋白酶敏感的肽段連接。這些結(jié)構(gòu)域中有些能與其他ECM(如膠原、蛋白聚糖)結(jié)合，使細(xì)胞外基質(zhì)形成網(wǎng)絡(luò)；有些能與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，使細(xì)胞附著ECM。FN肽鏈中的一些短肽序列為細(xì)胞表面的各種FN受體識(shí)別與結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。如在FN肽鏈中央與細(xì)胞相結(jié)合的模塊中存在RGD(Arg-Gly-Asp)序列，是細(xì)胞表面某些整合素受體識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)[12]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示FN可以促進(jìn)多種細(xì)胞黏附、增殖[13-14]。由于表皮類干細(xì)胞均坐落于基底膜上，只有在發(fā)生分化后逐漸與基底膜分離，向上遷移[15]。有研究者利用這一特征將未分選的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞懸液接種于包被有Ⅳ型膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等的培養(yǎng)皿上進(jìn)行分選[16]。結(jié)果提示，在Ⅳ型膠原上黏附20 min后收獲的細(xì)胞占全部基底層細(xì)胞的10%；纖維粘連蛋白上黏附5 min后獲得的細(xì)胞占全部基底層細(xì)胞的28%；快速黏附于層粘連蛋白上的細(xì)胞克隆形成能力沒有明顯增加。人毛囊干細(xì)胞主要富集于人毛囊隆突部外跟鞘[17-18]。所以本組實(shí)驗(yàn)選擇FN作為鋪層，觀察其是否促進(jìn)ORS細(xì)胞的黏附和增殖，結(jié)果表明FN鋪層比不鋪層促進(jìn)人毛囊ORS細(xì)胞黏附、增殖。由此認(rèn)為，人FN鋪層可以作為一種有效的促進(jìn)人毛囊干細(xì)胞黏附、增殖的方法，可代替3T3滋養(yǎng)層，避免傳統(tǒng)方法使用3T3滋養(yǎng)層培養(yǎng)人毛囊干細(xì)胞有異種細(xì)胞混入的一系列問(wèn)題。

FN的常用濃度為5 μg/cm2，但是在使用該濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附雖然較快，但是細(xì)胞形態(tài)變大，老化明顯，且不呈克隆樣生長(zhǎng)。所以本實(shí)驗(yàn)降低了FN濃度，并且比較了4個(gè)不同數(shù)量級(jí)FN濃度對(duì)人毛囊干細(xì)胞黏附和增殖能力的影響，取得最佳FN濃度范圍。但是FN的常用濃度5 μg/cm2不如10 ng/cm2適合毛囊干細(xì)胞的生長(zhǎng)，這個(gè)原因尚有待于進(jìn)一步研究。

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The experimental study of the most suitable for human hair follicle stem cell adhesion of fibronectin concentrations*

WUWei,DUANHui-chuan,CAOYi-lin△

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ShanghaiNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Objective To find the most suitable for human hair follicle stem cell adhesion of fibronectin (fibronectin,FN) concentrations.Methods The fresh fibronectin diluted to the desired concentration.The experiment is divided into the following four concentrations:5 μg/mL,200 ng/mL,10 ng/mL,0 ng/mL.Using enzyme digestion isolated from human hair follicle cells,the original generation of value-added hair follicle stem cells and cloning efficiency in a dish with different concentrations of plies,statistical analysis ply concentration most suitable for human follicle stem cells cultured in vitro.Results The same number of cells seeded in the same sample,do the cloning efficiency was measured in the first eight days of primary culture do Giemsa staining results:dish plies 0 ng/cm2of cloned groups of small,small number; 10 ng/cm2Overlay dish,cloning large group and number,the smaller the dish 200 ng/cm2and 5 μg/cm2plies cloned groups a small number.Take 10 samples,respectively,four FN Overlay concentration cloning efficiency statistical analysis found that,10 ng/cm2overlay genomic clone for maximum efficiency.10 ng/cm2overlay the strongest concentration of cell proliferation,and the other three groups were statistically significant,200 ng/cm2and the rest 3 group of concentrations were not statistically different.Conclusion 10 ng/cm2concentration is the best FN overlay.

hair follicle stem cells; external root shealth; tissue engineering; fibronectin; cell culture

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271046)。

吳巍，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事毛囊干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究?！?/p>

，E-mail:caoyilin169@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.002

A

1672-9455(2015)12-1661-04

2015-01-25

2015-04-22)