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        葡萄糖的測定方法與應用研究進展*

        2015-03-16 19:29:35李秋順李恒杰李大海史建國
        傳感器與微系統(tǒng) 2015年12期
        關鍵詞:葡萄糖氧化酶葡萄糖傳感器

        馮 東,李秋順,劉 鳳,李恒杰,李大海,史建國

        (1.山東省生物傳感器重點實驗室 山東省科學院生物研究所,山東 濟南250014;2.山東省金鄉(xiāng)縣雞黍鎮(zhèn)中學,山東 濟寧272208;3.濟寧市高級職業(yè)學校,山東 濟寧272100)

        0 引 言

        葡萄糖是易溶于水、有甜味、在自然界分布極廣的一種無色單糖,用途十分廣泛。在人體中,葡萄糖能快速補充能量、促進肝臟解毒、加強記憶等。葡萄糖的濃度對生理活動有很大影響。如果濃度過低,可能造成中風或其他的血管疾病;濃度過高會導致肥胖、糖尿病、腎臟病、心臟病及神經(jīng)損傷等[1~3]。在發(fā)酵生產(chǎn)中,葡萄糖是菌體生長和產(chǎn)物合成的主要碳源,其含量直接決定著生產(chǎn)菌增殖、代謝的數(shù)量[4]。此外,葡萄糖是食品加工、造酒、制藥、制鏡、印染制革等生產(chǎn)的重要原料[5]。因此,準確測定葡萄糖含量對于糖尿病等疾病的治療決策和工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)量的控制具有重要意義。

        1 葡萄糖的檢測方法

        目前,已經(jīng)發(fā)展的葡萄糖檢測方法很多,其原理有:利用化學性質(zhì)(還原性)來測定、利用其物理性質(zhì)來測定、結合特異性相互作用來測定等,實際可根據(jù)應用場合來選擇適合的測定方法。酶法測定也是葡萄糖測定的常用方法,此類方法易于發(fā)展成測定儀器,本文也將專門介紹。

        1.1 利用化學性質(zhì)測定

        1.1.1 氧化還原滴定法

        氧化還原滴定法是指將待測樣品精密加碘滴定液后,邊振搖邊滴加NaOH 滴定液,在暗處放置30 min,加稀硫酸,用硫代硫酸鈉滴定液滴定,至近終點時,加淀粉指示液繼續(xù)滴定至藍色消失,根據(jù)滴定液使用量,計算葡萄糖的含量。該方法在測定右旋糖酐40 葡萄糖注射液中葡萄糖的含量中被普遍采用。

        1.1.2 碘—淀粉體系褪色光度法

        碘與淀粉體系褪色光度法的原理是利用葡萄糖還原性和碘與淀粉能形成藍色配合物的性質(zhì)。待測液中加入適量NaOH 后,I2與NaOH 生成的NaIO 能定量地將葡萄糖氧化成葡萄糖酸,過量的NaIO 則歧化生成NaIO3和NaI。然后將體系調(diào)至酸性,NaIO3與NaI 反應重新生成I2,析出的I2又與淀粉形成藍色配合物。反應前后的吸光度差與加入的葡萄糖含量呈良好的線性關系,據(jù)此可以測定葡萄糖的含量。

        梁奇峰等人采用此法測定蜂蜜樣品中葡萄糖含量,結果顯示,在葡萄糖含量1.00 ~8.00 mg/L 的范圍內(nèi),反應前后吸光度差與加入的葡萄糖含量有良好的線性關系。測得葡萄糖含量為29.4%,相對標準偏差為0.6%(n=6),加標回收率為98%~102%(n=6),檢出限為0.0152 mg/L,測定結果與國標高效液相色譜法相近[6]。

        1.1.3 葡萄糖己糖激酶法

        其原理是己糖激酶催化葡萄糖生成葡糖—6—磷酸。之后葡糖—6—磷酸被氧化,同時產(chǎn)生還原型β—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。系統(tǒng)將監(jiān)測340 nm 的光吸收變化,該變化與樣品中的血糖濃度呈正比,依此計算并給出血糖濃度。

        1.2 利用物理性質(zhì)測定

        1.2.1 中紅外衰減全反射光譜法

        葡萄糖在中紅外波段具有1 152,1 108,1 080,1 035,992 cm-1等5 個葡萄糖基頻特征吸收峰,因此,中紅外衰減全反射(attenuated total reflectance,ATR)光譜方法能夠測量葡萄糖濃度。

        孫長月等人采用中紅外ATR 光譜法,分別采集自然狀態(tài)和滲透狀態(tài)時皮下組織中的葡萄糖的光譜數(shù)據(jù),應用二維相關光譜技術分析了兩種狀態(tài)下組織液中的葡萄糖濃度。結果表明:利用低頻超聲和真空負壓等物理或化學輔助方法將組織液滲透到皮膚表層,可以實現(xiàn)中紅外ATR 光譜法檢測皮下組織液中葡萄糖[7]。

        余松林等人利用ATR 傳感器測量了磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中葡萄糖濃度。結果表明:5 個測量波長下的吸收度與葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(R2>0.99,SD <0.000 4,P <0.000 1),且該波長可調(diào)諧激光光譜測量系統(tǒng)的靈敏度是傳統(tǒng)傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀的4 倍左右[8]。

        1.2.2 高效液相法

        高效液相色譜(HPLC)法是檢測生化分子的通用方法,葡萄糖液可以用此法測定。葛姍姍等人采用HPLC 法,測定紅腺忍冬葉水提液中葡萄糖的含量。12 批次紅腺忍冬葉的檢測結果表明,該方法能使葡萄糖和其它物質(zhì)得到良好的分離。線性范圍為33.75 ~2 160 mg/L,精度為1.31%,穩(wěn)定性分別為2.25%,重復性為1.85%,平均加樣回收率為97.58%[9]。

        楊軍等人采用HPLC 法檢測基因工程菌發(fā)酵液中葡萄糖的含量。其使用Aminex HPX—87H 柱(300 mm×7.8 mm,9 μm),以5 mmol/LH2SO4溶液作為流動相,在柱溫35 ℃、流速0.60 mL/min 的條件下,用示差折光檢測器對重組大腸埃希菌和畢赤酵母發(fā)酵過程中的葡萄糖含量進行檢測。結果表明:在標準曲線線性范圍內(nèi),葡萄糖濃度與峰面積呈良好的線性關系,相關系數(shù)在0.999 97 ~0.999 98 之間,平均加樣回收率為102.18%;重復6 次檢測發(fā)酵液,葡萄糖峰面積的RSD 為0.15%[10]。

        1.3 利用特異性相互作用

        利用特定物質(zhì)對葡萄糖分子的特異性識別,可以結合表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)等技術進行測定。當金膜表面配位體與分析物發(fā)生相互作用,會導致SPR 信號變化,從而進行測定。

        黎振華等人通過特異性識別作用在SPR 傳感器的金膜表面構建了伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜。當有葡萄糖存在時,膜被分解,從而實現(xiàn)對葡萄糖的靈敏檢測。結果表明,該傳感器可以選擇性地檢測0.1 ~100 mmol/L濃度范圍內(nèi)的葡萄糖溶液,且敏感膜可以多次再生使用[11]。

        1.4 酶法測定

        1.4.1 葡萄糖氧化酶法

        葡萄糖氧化酶法原理如下:葡萄糖被葡萄糖氧化酶(GOD)氧化生成葡萄糖酸和H2O2,H2O2又經(jīng)辣根過氧化物酶(POD)作用,分解出氧,將無色的4—氨基安替比林和苯酚偶聯(lián)氧化,并縮合成紅色醌亞胺,其顏色深淺與葡萄糖濃度呈正比,在530 nm 下的吸收峰度值會隨葡萄糖濃度的增加而增加。利用這一原理可以測定葡萄糖含量[12]。

        1.4.2 葡萄糖氧電極法

        葡萄糖氧電極法的原理是采用氧消耗速率檢測葡萄糖,首先將氧電極置于含有適量葡萄糖氧化酶的溶液中,然后加入待測樣品,樣品中的葡萄糖被氧化而消耗氧。由于氧消耗量與血糖濃度呈正比,而電極的極限擴散電流又與溶液中的氧含量呈正比,因此,氧電極值即可反映樣品中血糖濃度。

        閆長領等人采用電化學聚合技術,用摻雜苯磺酸鈉的聚吡咯(PPy)導電薄膜修飾鉛筆芯電極,在修飾電極表面吸附葡萄糖氧化酶制備了葡萄糖生物傳感器。該生物傳感器抗干擾能力強、穩(wěn)定性好,響應電流和葡萄糖濃度在0 ~0.7 mmol/L 范圍內(nèi)有良好的線性相關度(R=0.997 6),靈敏度為26.10 μA/mmol/L,平均響應時間約為6.5 s,檢測下限為47.2 μmol/L[13]。

        Zhang Lingling 等人通過恒電位陽極氧化法制備了TiO2納米管陣列,并通過物理吸附的方式將GOD 固定在納米管陣列上,開發(fā)了一種簡單、廉價的檢測葡萄糖的電化學生物傳感器。該傳感器對葡萄糖的響應時間為8 s,線性范圍是0.4 ~3.6 mmol/L 檢測限為5 μmol/L,靈敏度為56.7 μA/cm2/mmol/L,并且2 mmol/L 果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖均對測試結果無干擾[14]。

        1.4.3 納米材料模擬酶比色法

        葡萄糖氧化酶傳感器檢測葡萄糖濃度,具有專一性高、反應速度快等特點。但酶本身固有的不穩(wěn)定性,易受溫度、濕度以及pH 值等環(huán)境條件的影響而失去活性,而且葡萄糖氧化酶價格昂貴、制備復雜,這在一定程度上限制了酶傳感器的應用。利用具備催化活性的納米材料,能夠研制無酶葡萄糖傳感器。

        石文兵等人基于CeO2NPs 催化TMB 顯色反應與H2O2濃度的線性關系,構建了測定血樣中葡萄糖的模擬酶比色分析檢測方法。他們首先合成了一種穩(wěn)定和水溶性的聚丙烯酸修飾的CeO2NPs,發(fā)現(xiàn)CeO2NPs 能夠催化H2O2氧化,表現(xiàn)出過氧化物模擬酶的催化活性。在優(yōu)化條件下,對葡萄糖的線性響應范圍為0.5 ~10 mmol/L,檢出限為0.1 mmol/L。對1.0 mmol/L 葡萄糖進行11 次平行測定,其相對標準偏差為2.4%。即使果糖、乳糖和麥芽糖的濃度高達5 mmol/L,也不會干擾葡萄糖的測定,具有很高的選擇性[15]。

        1.4.4 無酶型葡萄糖電化學法

        無酶葡萄糖電化學法也是不使用葡萄糖氧化酶的葡萄糖測定方法,具有較高的穩(wěn)定性、良好的重現(xiàn)性和成本低廉等特點,近年來得到了快速發(fā)展。

        目前,已經(jīng)有單一金屬(Pt,Pd,Au 等)、雙金屬(Pt—Au,Pt—Pb,Pt—Ru,Pt—Bi,Pt—Ti 等)及碳納米管、碳纖維、介孔碳等納米材料被用于無酶型葡萄糖電化學傳感器的研制。

        易靜等人通過電化學沉積的方法將Pt—Pd 雙金屬納米粒子沉積在裂解碳納米管(UCNTs)修飾的電極表面上,制備了Pt—Pd/UCNTs 無酶葡萄糖傳感器。該傳感器對0 ~20 mmol/L濃度范圍內(nèi)的葡萄糖有良好的響應,不受Cl-等物質(zhì)的干擾,表現(xiàn)了良好的選擇性[16]。

        Sejin Park 等人利用納米級尺寸的鉑介孔結構建立了非酶型葡萄糖電流傳感器。該傳感器對葡萄糖的靈敏度高達9.6 μA/cm-2/mmol/L,且不受抗壞血酸和對乙酰氨基酚等物質(zhì)的干擾,對葡萄糖有較好的選擇性。即使在高濃度氯離子的存在下,也表現(xiàn)了較好的重復性[17]。

        雖然葡萄糖的測定方法很多,但各種方法均有適合應用的場合。氧化還原滴定法等化學方法利用的是葡萄糖的還原性,測定容易進行,但其它單糖和其它還原性物質(zhì)均會干擾測定結果;中紅外穿透深度有限,采用中紅外ATR 光譜法獲得深層液體中的葡萄糖信息是尚需解決的技術難題;高效液相色譜法結果準確,但進行復雜樣品測定時要反復摸索分離條件,不利于快速測定;SPR 法檢測靈敏度高,但需要精心設計與葡萄糖特異性作用的分子并修飾到金膜表面,對設備的要求也很高;酶法測定特異性好,不易受其它物質(zhì)干擾,但酶的成本高,對應用領域也有限制。因此,沒有一種測定方法能夠使用所有場合,需要根據(jù)情況加以選用。

        2 葡萄糖檢測儀器在實際生產(chǎn)中的應用

        1)血糖儀

        血糖儀按照工作原理分為葡萄糖氧化酶光化學比色法和電極法兩大類。光化學比色法血糖儀主要有國內(nèi)市場強生穩(wěn)步ONE Touch Sure Step、羅氏ACCU-CHEK Active(活力型)。電極法便攜式血糖儀是測定血液中葡萄糖含量的一種簡便攜帶的儀器,其原理是葡萄糖與含有葡糖糖酶和氰鐵化物的試紙接觸后產(chǎn)生一個小電流,電流通過血糖儀測定,并顯示相應數(shù)值。它具有靈敏度高、檢驗周轉期短、容易使用、用血量極少、操作簡便以及分析速度快等優(yōu)點,是目前臨床測定血糖水平的常用手段,已被廣泛應用于臨床各科室中。以電極法為代表的幾款即時檢驗血糖儀(POCT)如德國拜耳的拜安康TM、拜安捷2、美國雅培公司的Optium Xceed、強生公司的LIFE SCAN 均已在臨床中發(fā)揮作用。

        2)全自動葡萄糖生物傳感分析儀

        在國內(nèi),山東省科學院生物研究所史建國、馮東等人以葡萄糖氧化酶—電極法原理為基礎,研制的SBA 系列葡萄糖生物傳感分析儀[18]在國內(nèi)處于比較領先的地位,該種傳感器具有對不受待測液中其他成分的干擾、儀器重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好、成本低、檢測精度高、檢測速度快等優(yōu)點,突破了僅僅處在實驗室試驗研究階段的瓶頸,已經(jīng)在發(fā)酵工業(yè)、冷卻肉糖原、醬油成分分析、醫(yī)學檢驗等實際生產(chǎn)領域被廣泛應用。

        在國外,美國YSI 公司的YSI2300 STAT PLUS 葡萄糖乳酸分析儀、德國EKF 公司的BIOSEN C—Line 葡萄糖/乳酸分析儀、瑞典Chemel AB 公司的SIRE 系列葡萄糖分析儀均已被廣泛地用于食品、發(fā)酵工業(yè)葡萄糖的離線測量。

        3 結束語

        以酶為基礎的葡萄糖傳感器研究相對成熟,已經(jīng)走出實驗室研究階段,在生產(chǎn)中得到了較為廣泛的應用。然而,酶的活性容易隨環(huán)境的變化而逐漸減低甚至喪失,造成了酶葡萄糖傳感器局限于高昂的成本和較低的使用壽命。21 世紀以來,具有新性能的各種納米材料不斷涌現(xiàn),為新型葡萄糖傳感器的研發(fā)提供新的機遇,雖然非酶葡萄糖傳感器的研究現(xiàn)在還只是停留在實驗室階段,但隨著研究方法的不斷更新和新技術工藝的不斷完善,有望在將來研制出靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性好、費用低、擁有較長壽命的、可以在工業(yè)生產(chǎn)中使用的非酶葡萄糖傳感器。傳統(tǒng)方法與熒光淬滅、拉曼光譜等方法的聯(lián)合應用也有望在新型葡萄糖的傳感器研制方面取得進展,解決發(fā)酵過程中需要取樣、無法在原始發(fā)酵液實時檢測的難題。同時,與電腦、手機等智能系統(tǒng)網(wǎng)絡的結合也有望在葡萄糖的連續(xù)、在線、實時的檢測方面以及糖尿病遠程檢測診療等方面取得新成就。

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