郭楠楠

(深圳大學生命科學學院，廣東深圳518000)

肝癌即肝臟惡性腫瘤，其中的原發(fā)性肝癌是我國高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤，由于病毒性肝炎和環(huán)境等因素的影響，肝癌有逐年上升的趨勢，且肝癌病人的相對生存率極低，所以對于治療肝癌的新藥物的需要就顯得尤為迫切。

蒼術(shù)酮是傳統(tǒng)中藥白術(shù)的有效成分之一，屬于倍半萜類化合物，目前關(guān)于蒼術(shù)酮的藥理作用報道不多，已有的研究表明蒼術(shù)酮具有降血糖、抗衰老、抗炎、保護肝損傷等作用，而目前國內(nèi)外關(guān)于蒼術(shù)酮對肝癌細胞增殖的抑制及其凋亡發(fā)生機制的研究不多，為此筆者通過檢測蒼術(shù)酮對肝癌細胞活性的影響、細胞形態(tài)的變化及對細胞周期和凋亡的影響來探討其凋亡機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗儀器。CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀、熒光顯微鏡。

1．1．2 試驗試劑。蒼術(shù)酮由深圳大學化工學院提供;CCK－8、細胞周期與凋亡試劑盒均由碧云天生物研究所提供;HepG2購自上海生物研究所。

1．1．3 細胞培養(yǎng)。試驗所用細胞需放置于含有5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，用含10%胎牛血清及雙抗(青霉素/鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng);用0．25%胰酶－EDTA消化傳代，放于5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1．2 方法

1．2．1 CCK－8檢測蒼術(shù)酮對細胞增殖的抑制作用。取對數(shù)期生長細胞，胰酶消化吹散成單細胞狀態(tài)，調(diào)整細胞到合適濃度接種于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液，每孔加10、25、50、85、100 μg/ml的蒼術(shù)酮溶液處理，同時設(shè)立調(diào)零組和對照組，每組6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h后，每孔10μl的CCK－8溶液，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標儀上測各孔450 nm吸光度值，按以下公式計算細胞活力:細胞活力(%)=［(處理組 －空白組)/(對照組 －空白組)］×100%。

1．2．2 相差顯微鏡觀察蒼術(shù)酮誘導細胞形態(tài)的變化。取對數(shù)期生長的細胞，胰酶消化離心后吹散成單細胞狀態(tài)，以適當細胞濃度接種于24孔板，每孔1 ml，培養(yǎng)24 h后，換25、75、100μg/ml藥物組處理，設(shè)對照組，24 h后放置相差顯微鏡下進行觀察。

1．2．3 蒼術(shù)酮誘導HepG2細胞的細胞核的變化。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整到適當細胞濃度接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后，換不同濃度含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，加入固定液0．5 ml，固定10 min。去除固定液，PBS洗滌細胞2遍，每次3 min，盡量吸盡PBS。加入0．5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min。去除染色液，PBS洗滌2遍，每次3 min，吸盡PBS，滴加一滴抗熒光淬滅封片液，即可在熒光顯微鏡下觀察。

1．2．4 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞的凋亡。取對數(shù)期生長細胞，消化后吹散成單細胞狀態(tài)，以適當?shù)募毎麧舛冉臃N于六孔板每孔2 ml。培養(yǎng)24 h后，換25和50μg/ml藥物組處理，設(shè)對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞待用。PBS重懸離心細胞2次，棄上清，加入195μl AnnexinV－FITC結(jié)合液重懸細胞，加入5μl AnnexinV－FITC輕輕混勻，加入5μl碘化丙啶染色液混勻，室溫避光孵育20 min，即可上機通過流式細胞儀進行檢測。

1．2．5 細胞周期的檢測。取對數(shù)生長期細胞消化后吹散成單細胞狀態(tài)，以適當?shù)募毎麧舛冉臃N于六孔板每孔2 ml。培養(yǎng)24 h后換25和85μg/ml藥物組處理，設(shè)對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞待用。預冷PBS洗滌離心細胞2次，加入1ml預冷70%乙醇混勻，4℃固定4 h。離心沉淀細胞，PBS洗滌離心一次，每管加入0．5 ml碘化丙啶染色液，37℃水浴30 min，隨即可用流式細胞儀上機檢測。

1．2．6 數(shù)據(jù)分析。每項試驗至少重復3次，結(jié)果是以平均值±標準差的方式表示，方差分析采用t－test，P＜0．05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 蒼術(shù)酮對Hep G2細胞生長的抑制作用 由圖1可知，蒼術(shù)酮對HepG2細胞的生長有抑制作用。不同濃度的蒼術(shù)酮處理細胞24、36、48 h后，隨著蒼術(shù)酮濃度的升高，對HepG2細胞的增殖抑制作用也增加，表現(xiàn)為細胞活力的降低;在10～100μg/ml濃度范圍內(nèi)的細胞活力與該組對照相比均有顯著差異(P＜0．01)。

2．2 相差顯微鏡觀察蒼術(shù)酮處理后Hep G2細胞形態(tài)的變化 通過相差顯微鏡觀察可以看出蒼術(shù)酮能抑制肝癌細胞的生長(圖2)。沒經(jīng)藥物處理的細胞呈不規(guī)則多邊形貼壁生長，細胞緊密相接，細胞邊緣輪廓清晰，生長狀態(tài)飽滿，有的甚至堆積生長;而經(jīng)藥物蒼術(shù)酮處理的細胞變得扁平，脫壁，細胞間接觸不緊密，細胞邊緣輪廓不完整，碎片狀物質(zhì)增多，胞漿中類似顆粒物的物質(zhì)增多。

2．3 熒光顯微鏡觀察蒼術(shù)酮作用后HepG2細胞的細胞核變化 由圖3可見，未經(jīng)蒼術(shù)酮作用的細胞經(jīng)Hochest33258染色后細胞核呈圓形或橢圓形，分布均勻，無深染的明亮點，熒光顯微鏡觀察下呈現(xiàn)均勻的弱藍色熒光;而經(jīng)蒼術(shù)酮處理的細胞，隨著藥物劑量的加大，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，有許多明亮點出現(xiàn)，這可能是凋亡早期細胞核染色質(zhì)凝集所致，有些還具有細小的碎片，可能與細胞核裂解有關(guān)。

2．4 蒼術(shù)酮對Hep G2細胞凋亡的影響 分別用蒼術(shù)酮濃度為0、25、50μg/ml培養(yǎng)液處理細胞24 h后，細胞早期凋亡與晚期凋亡顯示(圖4)，在蒼術(shù)酮濃度較低時，晚期凋亡的細胞比例較低，隨著藥物濃度的增加，晚期凋亡的細胞比例增加，但小于早期凋亡細胞的比例，暗示著蒼術(shù)酮在較高濃度時可能更傾向于促進細胞早期凋亡。

2．5 蒼術(shù)酮對Hep G2細胞周期的影響 細胞周期是指由 細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需時間分為4個階段。其測定原理就是根據(jù)細胞不同時期(G1、S、G2、M)中DNA的含量不同進行的，通過檢測不同時期與DNA結(jié)合的熒光染料的熒光強度來反映DNA含量。結(jié)果顯示(圖5)，與正常組相比，25和85μg/ml蒼術(shù)酮處理細胞24 h后，隨著蒼術(shù)酮作用濃度的升高，G1期所占細胞的數(shù)量減少(圖中左邊數(shù)第1個峰)，G2期所占細胞的數(shù)量逐漸增多(圖中左邊數(shù)第2 個峰)，0、25、85 μg/ml濃度對應下的 G2期細胞百分比分別是12．8%、16．9%、28．2%。由此表明蒼術(shù)酮抑制HepG2細胞增殖是通過將細胞阻滯在G2/M期。

3 結(jié)論與討論

蒼術(shù)酮是中藥材白術(shù)的有效成分之一，而作為傳統(tǒng)中藥的白術(shù)素來有“南術(shù)北參”的美譽，其祛風散寒、健脾益氣、明目的功效早在我國古典藥典中就有記載。隨著近年來對白術(shù)藥理學的研究，人們發(fā)現(xiàn)白術(shù)還有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用，只是長期以來，白術(shù)只是作為其他中藥的配方來服用，大大限制了它自身的利用。如果把白術(shù)中的成分提純，將無疑大大提高它的利用價值。目前針對白術(shù)的有效成分之一蒼術(shù)酮的研究報道就很少，董大京等研究表明蒼術(shù)酮對高血壓有獨特的療效［1］，Hwang等研究表明蒼術(shù)酮對肝損傷的保護也起到一定的作用［2］。蒼術(shù)酮屬于倍半萜類化合物，具有的多種生物學活性也有待開發(fā)。細胞凋亡是細胞在受到外界環(huán)境因素及病理性信號刺激后發(fā)生的由基因控制的一系列細胞主動有序的死亡過程［3］。大量試驗表明，目前對于一些類似傳統(tǒng)中藥黃芪、紫杉醇等［4－6］均可以通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮各自獨特的抗腫瘤作用，而有關(guān)蒼術(shù)酮對腫瘤細胞抑制影響作用的報道不是很多。

該試驗中，主要探討了蒼術(shù)酮對HepG2細胞的生長抑制作用，細胞的增值活性是反映細胞增值能力與生理功能的重要指標，當細胞因外界刺激受到損傷時，首先表現(xiàn)的就是其增值活性的降低。CCK－8法是目前測定細胞增值與細胞毒性的常用方法之一，CCK－8屬于MTT的升級產(chǎn)品，且重復性好，其測定原理為WST－8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞的毒性成反比。顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。該試驗結(jié)果表明，隨著蒼術(shù)酮劑量濃度的增大和作用細胞時間的延長，細胞增值受到抑制，細胞活力降低。采用不同濃度蒼術(shù)酮作用HepG2細胞后，在相差顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞貼壁生長，細胞緊密相接，生長旺盛，藥物作用后細胞變得扁平，細胞間接觸不緊密，胞漿中類似顆粒物的物質(zhì)增多，且伴隨有碎片物質(zhì)的產(chǎn)生;Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下進行觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的細胞核染色后成均勻弱藍色熒光，經(jīng)藥物處理的細胞由于部分染色質(zhì)會出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，所以染色的細胞核會出現(xiàn)許多明亮點。此外，該試驗用流式細胞儀對細胞周期的測定表明蒼術(shù)酮能通過將細胞阻滯在G2/M期來抑制細胞的增殖。

總之，該試驗研究表明蒼術(shù)酮對HepG2細胞的生長有明顯抑制作用，并誘導凋亡的發(fā)生，其作用強度隨藥物濃度成正相關(guān)，有明顯的劑量依賴性，這對今后深入研究蒼術(shù)酮對肝癌細胞的凋亡機制奠定一定的理論基礎(chǔ)，也為進一步深入研究蒼術(shù)酮作為治療肝癌的新藥和臨床應用提供初步的試驗依據(jù)。

［1］董大京，劉蘭祥，張建．蒼術(shù)酮對高血壓的療效［J］．河北醫(yī)學，1997，3(4):63 －64．

［2］HWANG JM，TSENG TH，HSIEH Y S，et al．Inhibitory effect of atractylon on tert－butyl hydroperoxide induced DNA damage and hepatic toxicity in rat hepatocytes［J］．Arch Toxicol，1996，70:640 －644．

［3］VAN ENGELAND M，NIELAND L J，RAMAEKERS F C，et al．Annexin V－affinity assay:a review on an apoptosis detection syetem based on phosphatidylserine exposure［J］．Cytometry，1998，31:1 －9．

［4］KUMMALUET．Molecular mechanism of herbs in human lung cancer cells［J］．JMed Assoc Thai，2005，88:1725 －1734．

［5］劉偉，畢富勇．中藥誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究進展［J］．安徽醫(yī)學，2009(10):1250 －1253．

［6］鄭煒望，華海清．中藥誘導肝癌細胞凋亡的研究進展［J］．世界華人消化雜志，2009(28):2915 －2918．