陳澤斌， 李 冰， 王定康， 余 磊， 徐勝光， 任 禛， 靳 松， 張永福，彭聲靜

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214;2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214;3.中國科學(xué)院昆明動物研究所，云南 昆明 650223;4.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，云南 昆明 650214)

關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌，現(xiàn)已從多種健康植物的根、莖、葉、果實、種子中分離出包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共計129種(隸屬于54個屬)［1］。植物內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種主要分布于假單胞屬(Pseudommonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)4 個屬［2］，研究較系統(tǒng)的植物有棉花、小麥和花生［3］。迄今還未發(fā)現(xiàn)不存在內(nèi)生細(xì)菌的植物種類或器官。

核桃，又稱胡桃、羌桃，為胡桃科植物，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”，被譽為“萬歲子”、“長壽果”［4-7］。核桃中86%的脂肪是不飽和脂肪酸，富含銅、鎂、鉀、維生素B6、葉酸和維生素B1，也含有纖維、磷、煙酸、鐵、維生素B2和泛酸，能破血祛瘀、潤燥滑腸，并能防癌抗癌、補腦［8］。中國核桃的分布很廣，主要產(chǎn)區(qū)在云南、陜西、山西、四川、河北、甘肅、新疆、安徽等省(區(qū))。

已有研究結(jié)果表明植物內(nèi)生細(xì)菌的種類組成隨植物的品種、生長期、器官的不同而異［9］。目前關(guān)于核桃內(nèi)生菌多樣性的研究均采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，研究的部位集中于核桃植株的根、莖、葉［10-11］，而對于可供食用的部分——核桃仁這一器官的內(nèi)生細(xì)菌研究未見報道。本研究擬采用Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)對核桃仁內(nèi)生細(xì)菌種類組成進行分析，該方法相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)及以16SrDNA為基礎(chǔ)的非培養(yǎng)方法，能夠產(chǎn)生覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量，檢測到純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細(xì)菌種類，為豐富植物微生態(tài)學(xué)理論及基因工程菌的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

供試材料為云南省林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟林研究所提供的核桃品種(無性系)——細(xì)香核桃。

1.2 樣品消毒

將新鮮核桃仁用自來水沖洗干凈后用75%的乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分。消毒效果檢驗參照文獻(xiàn)［12］。

1.3 核桃仁總DNA提取

［13］的方法提取核桃仁總DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至 1 ng/μl。

1.4 16SrDNA-V4區(qū)的PCR擴增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的16SrDNA-V4區(qū)特異引物515F(5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GATCAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，并用高效和高保真酶(New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer)進行PCR，確保擴增效率和準(zhǔn)確性。

1.5 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，目的條帶用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.6 文庫構(gòu)建和測序

用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和 QPCR 定量，合格后使用 Miseq 測序［14-17］。測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.7 生物信息學(xué)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)用FLASH軟件拼接、Qiime軟件過濾、UCHIME Algorithm軟件去除嵌合體后，得到有效數(shù)據(jù)(Effective tags)［18］，剔除宿主葉綠體和線粒體序列，然后用Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋［19］，利用Mothur軟件做稀釋曲線分析，通過對OTUs進行豐度和α-多樣性分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成［20-22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長度分布

在核桃仁樣品總DNA的16S rDNA V4區(qū)中測得的63 190條序列，雙末端讀長(PE，Paired-end reads)分布在 189～359 bp范圍內(nèi)，長度為249 bp的序列最多，有62 621條(表1)。從序列長度的分布來看，與16SrDNA-V4區(qū)序列長度大致吻合。

2.2 OTUs數(shù)目統(tǒng)計及物種注釋分析

核桃仁樣品總DNA的16S rDNA V4區(qū)中共測得63 183條標(biāo)記(Tags，過濾后得到的拼接序列數(shù))，分為103個OTUs(97%的序列相似性)，包括61 980條獲得分類信息的標(biāo)記，1 203條低頻標(biāo)記(圖1)，被注釋到11個屬(表2)。從OTUs豐度聚類圖(圖2)來看，相對豐度為土壤桿菌屬(Agrobacterium)＞鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)=鹽單胞菌屬(Halomonas)。

表1 核桃仁內(nèi)生細(xì)菌16Sr DNA V4區(qū)序列長度的數(shù)量分布Table 1 Distribution of sequence length of 16Sr DNA V4 region of endophytic bacteria in walnut kernel

圖1 樣品中內(nèi)生細(xì)菌序列的標(biāo)記和OTUs的數(shù)目Fig.1 The quantities of tags and OTUs of endophytic bacteria in the sample

表2 核桃仁內(nèi)生細(xì)菌16S r DNA序列各分類水平上的序列數(shù)目Table2 Sequence number at each classification level of 16S r DNA of endophytic bacteria in walnut kernel

圖2 核桃仁內(nèi)生細(xì)菌16S r DNA序列OTUs豐度聚類圖Fig.2 Abundance clustering of OTUs of 16S r DNA of endophytic bacteria in walnut kernel

2.3 樣品中內(nèi)生細(xì)菌物種分類樹

從門的分類水平看，核桃仁內(nèi)生細(xì)菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria);從綱的分類水平看，核桃內(nèi)生細(xì)菌在 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，27.27%)、 α-變 形 菌 綱 (Alphaproteobacteria，72.73%)中均有分布;從目的分類水平看，核桃內(nèi)生細(xì)菌在鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales，27.27%)、根瘤菌目(Rhizobiales，45.45%)、海洋螺菌目(Oceanospirillales，27.27%)中均有分布;從科的分類水平看，核桃內(nèi)生細(xì)菌在根瘤菌科(Rhizobiaceae，45.45%)、鞘 脂 單 胞 菌 科 (Sphingomonadaceae，27.27%)、鹽單胞菌科(Halomonadaceae，33.33%)中均有分布;從屬的分類水平看，核桃內(nèi)生細(xì)菌在鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，27.27%)、鹽單胞菌屬(Halomonas，27.27%)、土壤桿菌屬(Agrobacterium，45.45%)中均有分布。由此可見，鞘氨醇單胞菌屬、鹽單胞菌屬、土壤桿菌屬是核桃內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種群(圖3)。

2.4 α-多樣性分析

隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線(圖4)、Chao1指數(shù)曲線(圖5)、Shannon指數(shù)曲線(圖6)的斜率在0～10 000的測序數(shù)量范圍內(nèi)逐漸上升，后趨向平坦并進入平臺期，說明再增加測序數(shù)量也不會產(chǎn)生新的OTU，也表明本研究測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖3 核桃仁中內(nèi)生細(xì)菌的分類Fig.3 Classification of endophytic bacterial species in sample walnut kernel

圖4 稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curve

圖5 Chao1指數(shù)曲線Fig.5 Chao1 index curve

圖6 Shannon指數(shù)曲線Fig.6 Shannon index curve

3 討論

16SrDNA很早就應(yīng)用在微生物菌種鑒定上，但利用高通量測序進行16S rDNA分析最早出現(xiàn)在2006年，Sogin等［22］應(yīng)用該技術(shù)對深海微生物群落進行了分析，隨后該技術(shù)在腸道微生物領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［23］。目前該技術(shù)應(yīng)用于植物內(nèi)生微生物的研究尚未見報道。本研究首次將近幾年迅速發(fā)展并成為主流的Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)應(yīng)用于植物內(nèi)生細(xì)菌研究，克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法通量低的缺陷，從基因組水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生微生物尚不能被分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸［24-25］，檢測到以往沒有檢測到的同樣扮演著重要角色的低豐度植物內(nèi)生細(xì)菌種類，豐富了植物內(nèi)生細(xì)菌資源，更準(zhǔn)確地反映了植物內(nèi)生微生物中不同豐度菌群的組成和比例。

就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性［26］。在對核桃內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA-V4變異區(qū)序列進行Illumina MiSeq高通量測序后，發(fā)現(xiàn)部分序列歸屬于宿主葉綠體和線粒體，存在一定比例的宿主污染現(xiàn)象，為了使細(xì)菌多樣性的分析結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，本研究剔除了宿主葉綠體和線粒體序列。但本研究只選擇了16S rDNA-V4區(qū)作為測序區(qū)域，未來研究應(yīng)在不同高通量測序平臺上評估樣品的復(fù)雜程度以及宿主的污染情況，選擇合理的測序區(qū)域或設(shè)計特異性更高的引物，制定更好的測序策略，以避免線粒體和葉綠體的干擾。

第一代Sanger測序由于其讀長長、準(zhǔn)確率高，能根據(jù)測得的全長16S rDNA序列注釋到種，但第一代Sanger測序通量較低，大規(guī)模測序成本高。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，一般每個樣品可以保證測定40 000～60 000個序列數(shù)，覆蓋深度非常大，對物種多樣性的分析十分有利，但是高通量測序讀長短，不可能將16S rDNA的9個可變區(qū)全部測序，所以往往只選擇1～3個可變區(qū)作為測序區(qū)域，單端測序長度為250 bp，雙端測序長度為500 bp，測序片段越短，后續(xù)對序列進行物種注釋時的分辨度越低，只能將內(nèi)生細(xì)菌注釋到屬的分類水平。

本研究發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)生細(xì)菌主要分布于鞘氨醇單胞菌屬、鹽單胞菌屬、土壤桿菌屬，這3個屬是核桃內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌屬。已有研究結(jié)果表明，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的底物廣泛，從多環(huán)芳烴類化合物、聚乙烯醇等高聚物到簡單無機物氮都能利用，某些種屬還能產(chǎn)生有價值的生物高分子(如β-胡蘿卜素、結(jié)冷膠)［27］。說明核桃內(nèi)生細(xì)菌可為復(fù)雜有機物的降解提供良好的微生物來源。目前關(guān)于鹽單胞菌屬細(xì)菌功能、代謝的研究尚未見報道，其作為內(nèi)生細(xì)菌的主要類群尚屬首次報道，未來應(yīng)進一步加強對其功能和代謝的研究。

參考文獻(xiàn):

［1］ 趙 旭，常思靜，景春娥，等.我國植物內(nèi)生菌研究進展［J］.中國沙漠，2010，30(1):87-91.

［2］ 徐亞軍.植物內(nèi)生菌資源多樣性研究進展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(24):149-152.

［3］ 胡桂萍，鄭雪芳，尤民生，等.植物內(nèi)生菌的研究進展［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，25(2):226-234.

［4］ 王 偉，翟梅枝，徐文濤，等.核桃內(nèi)生菌研究Ⅰ核桃內(nèi)生菌的分離及代謝產(chǎn)物活性研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17(1):77-81.

［5］ 高美娟，任建軍，師光祿，等.核桃青皮復(fù)配營養(yǎng)液對設(shè)施草莓的殺螨及營養(yǎng)效果［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29(6):1320-1325.

［6］ 劉廣勤，俞衛(wèi)東，曹仁勇，等.薄殼山核桃食藥用價值及加工利用研究進展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(12):306-303.

［7］ 李 麗，翟梅枝，楊 惠，等.核桃葉部內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性及 GC-MS 分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(10):292-295.

［8］ 李曉紅，傅本重，麻春花，等.不同表面消毒方法對核桃葉內(nèi)生菌分離效果的比較［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28(28):163-168.

［9］ 高智輝，翟梅枝，王云果，等.核桃內(nèi)生真菌的分離鑒定［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2012，27(5):121-123.

［10］李 麗，翟梅枝，楊 惠，等.核桃內(nèi)生真菌G3的分子鑒定及其生物學(xué)特性研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29(10):35-39.

［11］王建文，陳華紅，段亞霞，等.楚雄核桃內(nèi)生真菌分離及抗菌活性研究［J］.楚雄師范學(xué)院學(xué)報，2013，28(3):70-75.

［12］陳澤斌，代方平，寸林江，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌分離方法的優(yōu)化研究［J］.中國煙草學(xué)報，2014，20(1):90-95，102.

［13］陳澤斌，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等.非培養(yǎng)方法解析煙草根部內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2012，27(1):201-209.

［14］ CAPORASO JG，LAUBER CL，WALTERSW A，et al.Global patterns of 16SrRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108(Suppl 1):4516-4522.

［15］ YOUSSEF N，SHEIK C S，KRUMHOLZ L R，et al.Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(16):5227-5236.

［16］ HESSM，SCZYRBA A，EGAN R，et al.Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen［J］.Science，2011，331(6016):463-467.

［17］ LUO C，TSEMENTZI D，KYRPIDES N，et al.Direct comparisons of Illumina vs.Roche 454 sequencing technologies on the same microbial community DNA sample［J］.PloS One，2012，7(2):e30087.

［18］ EDGAR R C，HAASB J，CLEMENTE JC，et al.UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection［J］.Bioinformatics，2011，27(16):2194-2200.

［19］ EDGAR R C.UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads［J］.Nature Methods，2013，10(10):996-998.

［20］ WANG QL，GARRITY GM，TIEDJE JM，et al.Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into thenew bacterial taxonomy［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(16):5261-5267.

［21］ DESANTIST Z，HUGENHOLTZ P，LARSEN N，et al.Greengenes，a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(7):5069-5072.

［22］ SOGIN M L，MORRISON H G，HUBER JA，et al.Microbial diversity in the deep sea and the underexplored‘rare biosphere’［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103(32):12115-12120.

［23］南春燕，馬雅軍，徐建農(nóng)，等.中華按蚊幼蟲腸道細(xì)菌宏基因組的組成研究［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2013，31(2):114-119.

［24］ THOLOZAN JL，CAPPELIER J M，TISSIER JP，et al.Physiological characterization of viable-but-nonculturable campylobacter jejuni cells［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65(3):1110-1116.

［25］ AMMANN R R，LUDWIG W，SCHLEIFER K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.Microbiol Rev，1995，59(1):143-169.

［26］胡 楷，吳慶書.單細(xì)胞生物進化研究的進步［J］.遺傳，2002，24(1):104-110.

［27］胡 杰，何曉紅，李大平，等.鞘氨醇單胞菌研究進展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2007，13(3):431-437.