程 亮， 郭青云

(1.青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016;2.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016)

農(nóng)田雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的重要影響因 子之一，化學(xué)除草劑可有效去除農(nóng)田雜草并在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面起到不可低估的作用。但從20世紀(jì)70年代中期以來，抗藥性雜草種類不斷上升，環(huán)境污染問題日益顯現(xiàn)。微生物除草劑因其對目標(biāo)雜草以外的植物影響小、環(huán)境負(fù)效應(yīng)小、安全性高等優(yōu)勢而成為近年來雜草生物防治研究中的一個(gè)較為活躍的領(lǐng)域。

近年在生防真菌的新菌株篩選、致病力和寄主專一性測定、擴(kuò)散與流行規(guī)律、商品化產(chǎn)品開發(fā)等方面的研究取得了顯著進(jìn)展 。強(qiáng)勝等通過對雜草病原代謝產(chǎn)物的研究，先后成功研制出2種微生物源除草劑［4］。李俊、楊葉、李永龍等先后研究了有關(guān)病原微生物代謝產(chǎn)物的除草活性［5-7］。強(qiáng)勝、王惠、李榮金等對除草活性物質(zhì)開展了分離純化等研究［8-10］。Schulz等對從不同植物中分離到的6 500株內(nèi)生真菌進(jìn)行活性測定，發(fā)現(xiàn)80%～83%具有抗細(xì)菌、抗真菌和除草活性［11］。

內(nèi)生真菌代謝途徑及代謝物的多樣性不僅與其種屬有關(guān)，還與其所處的微生態(tài)環(huán)境有關(guān)。青藏高原獨(dú)特的環(huán)境條件孕育了獨(dú)特的微生物群落，但青海在雜草病原菌的收集及生防研究領(lǐng)域的相關(guān)工作較少。我們從2010年開始從青海共分離獲得53株微生物，其中在刺兒菜葉上獲得一株具有強(qiáng)致病力的植物內(nèi)生菌HL-1菌株。

本研究擬對菌株HL-1進(jìn)行菌餅致病性和發(fā)酵濾液除草活性等研究，并對其生防安全性進(jìn)行初步評估，旨在為今后深入研究、開發(fā)微生源除草劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集及病原菌的分離純化

從青海省化隆縣采集發(fā)病的刺兒菜(Cirsium setosum)葉片，將其分裝于自封袋中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對發(fā)病癥狀進(jìn)行記錄、拍照，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)［12］對刺兒菜葉片病害標(biāo)本進(jìn)行分離和培養(yǎng)，每個(gè)PDA培養(yǎng)基平板上放置5個(gè)組織塊，培養(yǎng)4 d后病組織表面出現(xiàn)菌絲，接種針挑取菌絲進(jìn)行病原菌的純化并編號(hào)。

1.2 HL-1菌株的致病性測定

1.2.1 菌餅的致病性測定 采集野外健康新鮮的豬殃殃(Galium aparine L.)、藜(Chenopodium album L.)、冬葵(Malva crispa L.)、酸模葉蓼(Polygonum lapathifolium L.)幼葉，用無菌水沖洗3次后自然晾干，放置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)內(nèi)，在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣取菌餅(Φ=8 mm)接種到葉片正面，以接種無菌的PDA培養(yǎng)基塊為對照，置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，分別于接種后3 d、5 d觀察葉片發(fā)病情況。

1.2.2 代謝產(chǎn)物的致病性測定 在培養(yǎng)7 d后的菌落邊緣取菌絲塊接種到裝有200 ml PD的培養(yǎng)瓶中，每瓶接5塊，25℃、150 r/min培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)液真空抽濾，濾液再用微孔濾膜(Φ=0.45μm)過濾獲得不含菌體的代謝產(chǎn)物濾液，將濾液噴霧接種于7～10葉期健康盆栽豬殃殃、藜、冬葵、酸模葉蓼植株上，接種量為每盆20 ml。接種后的雜草植株置于28℃、12 h光暗交替的人工氣候箱中用塑料袋套袋保濕培養(yǎng)。每處理重復(fù)4次，以只接種無菌PD培養(yǎng)液的植株作為空白對照。分別于處理后3 d、5 d和7 d后觀察雜草的發(fā)病情況，發(fā)病程度分級(jí)參照文獻(xiàn)［13］。處理7 d后計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和鮮質(zhì)量防效。計(jì)算公式如下:發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查葉片總數(shù)×100%;病情指數(shù)=Σ(各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)×100;鮮質(zhì)量防效=(對照雜草鮮質(zhì)量－處理雜草鮮質(zhì)量)/對照雜草鮮質(zhì)量×100%。

1.3 HL-1菌株對作物安全性測定

將HL-1菌株發(fā)酵濾液以每盆20 ml分別噴霧接種于3～4葉期的小麥(Triticum aestivum L.)、油菜(Brassica napus L.)、蠶豆(Vicia faba L.)、豌豆(Pisum sativum L.)、青稞(Hordeum vulgare L.)上，培養(yǎng)方法同方法1.2.2。每處理重復(fù)4次，以只接種無菌PD培養(yǎng)液的植株作為空白對照。7 d后調(diào)查作物發(fā)病情況。按以下標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)病程度:NS表示無癥狀(無病斑，植株正常生長);LS表示輕微感病(葉片分布零星斑點(diǎn)，生長略受抑制);MS表示中等感病(1/5～1/4的葉面積出現(xiàn)病斑，生長受抑制);SS表示嚴(yán)重感病(1/4以上葉片面積出現(xiàn)病斑，生長受到嚴(yán)重抑制)。

1.4 HL-1菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 將菌株HL-1于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態(tài)。將直徑為8 mm菌絲塊接種于培養(yǎng)基平皿(Φ=9 cm)，25℃培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌落生長形態(tài)，顯微鏡觀察其菌絲和孢子形態(tài)。

1.4.2 分子鑒定 菌株DNA提取參照文獻(xiàn)［13］。選取通用引物ITS4擴(kuò)增基因組DNA的 ITS區(qū)，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50.0μl)如下:4.0μl dNTP mixture(2.5 mmol/L)，ITS4(20.0 μmol/L)和 ITS5(20.0 μmol/L)各1.0μl，6.0μl的10×Taq緩沖液，1.0μl Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μl)，2.0 μl模板 DNA，35.0μl無菌去離子水。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，51℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，用溴化乙錠溶液(0.5μg/ml)染色15 min，通過Bio-Rad Gel Doc 2000成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。收集PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果用chromas.exe軟件進(jìn)行序列修正后，從NCBI Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本序列分別進(jìn)行菌株種內(nèi)比對。利用MEGA 5.0軟件采用近鄰歸群法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度自舉檢測(Bootstrap)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HL-1菌株對雜草的致病性

菌株HL-1菌餅接種到豬殃殃、藜、冬葵、酸模葉蓼3 d后，雜草葉片上可觀察到輕微病變，菌餅四周長出大量菌絲，圍繞菌餅四周形成一圈褐色斑紋，其中，冬葵葉片出現(xiàn)輕微發(fā)黃、失綠現(xiàn)象;藜葉片接種部位可見白色菌絲體，同時(shí)，菌絲穿透整個(gè)葉片，布滿葉背部，5 d后菌絲擴(kuò)展至整個(gè)雜草葉片;豬殃殃、冬葵整葉枯死;酸模葉蓼、藜葉片變黑腐爛。接種無菌PDA培養(yǎng)基的4種對照雜草葉片完好，沒有出現(xiàn)病變癥狀。菌餅致病性測定結(jié)果表明，HL-1菌株對這4種雜草離體葉片均表現(xiàn)為強(qiáng)致病性。

噴施發(fā)酵濾液3 d后，在供試雜草上出現(xiàn)不同程度的受害癥狀，豬殃殃、藜明顯表現(xiàn)出萎蔫、葉片卷曲的癥狀，冬葵葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，葉尖變黃，有零星病斑產(chǎn)生，酸模葉蓼部分葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)。5 d后，豬殃殃表現(xiàn)為莖葉發(fā)黑、枯死，藜表現(xiàn)為莖彎曲，葉片枯死，冬葵1/2葉片發(fā)黑，癥狀由葉到莖逐漸擴(kuò)展，酸模葉蓼出現(xiàn)大面積病斑，約1/2植株枯死。7 d后，豬殃殃、藜發(fā)病率高達(dá)98.10%和90.20%。發(fā)酵濾液對豬殃殃、藜、冬葵的平均鮮質(zhì)量防效分別達(dá)到69.31%、71.83%、65.54%，顯著高于發(fā)酵濾液對酸模葉蓼的平均鮮質(zhì)量防效(P＜0.05)(表1)。病情指數(shù)(表1)表明，豬殃殃、藜對菌株發(fā)酵濾液最敏感，雜草接種病菌7 d后始終無復(fù)蘇現(xiàn)象，病情不斷加重，直至整盆植株枯死(圖1)。無菌PD培養(yǎng)液(對照)對上述4種雜草葉片沒有影響(圖1)。表明，該菌株發(fā)酵濾液對豬殃殃和藜具有較好的防除效果。

表1 菌株HL-1發(fā)酵濾液對4種雜草致病力比較(7 d)Table 1 Comparison of the pathogenicities of metabolites produced by strain HL-1 against four weeds(7 d)

1 菌株HL-1發(fā)酵濾液的致病性(7 d)ig.1 Pathogenicity of metabolite produced by strain HL-1(7 d)

2.2 HL-1菌株對作物的安全性

菌株HL-1發(fā)酵濾液對春小麥和蠶豆均無致病性，作物長勢及株高未受影響，表現(xiàn)為不感病(NS);春油菜表現(xiàn)為輕微感病(LS)，5%葉片葉緣出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，植株無萎蔫現(xiàn)象，后期病斑不擴(kuò)展;青稞表現(xiàn)為輕微感病(LS)，少部分葉片葉脈部位有零星斑點(diǎn)，葉片發(fā)黃，后期病斑不擴(kuò)展;豌豆表現(xiàn)為輕微感病(LS)，株高抑制率為5.8%(表2)。

表2 供試作物對菌株HL-1的敏感性Table 2 Sensitivities of the crops to strain HL-1

2.3 HL-1 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 PDA平板上HL-1菌落呈同心圓生長，生長速度快，一周后滿皿。氣生菌絲發(fā)達(dá)，初期為白色，后期漸變?yōu)楹稚?，最后變?yōu)楹谏?圖2A)。菌絲有隔，中間部位凹縮(圖2B)。分生孢子有明顯的橫縱隔，孢子平面呈橢球形，不易萌發(fā)(圖2C)。

圖2 HL-1的形態(tài)特征(×1 000)Fig.2 Morphological characteristics of strain HL-1(×1 000)

2.3.2 分子鑒定 從用近鄰歸群法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可見，菌株HL-1的ITS與植物內(nèi)生菌屬的ITS高度相似，其中與內(nèi)生真菌 FJ450003.1、FJ450011.1和JN986768.1的匹配度均達(dá)到 99%。結(jié)合形態(tài)觀察，鑒定菌株HZ-1為內(nèi)生真菌。

圖3 基于ITS r DNA序列的菌株HL-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HL-1 based on ITS r DNA sequence

3 討論

植物病原毒素是植物病原產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在病原菌侵染寄主的過程中起著重要的作用，常常能加強(qiáng)病原菌的侵染危害程度。目前對具有除草活性的微生物代謝產(chǎn)物的報(bào)道很多，如Arshad 2011年［14］從木霉屬4個(gè)種的培養(yǎng)濾液中獲得的粗毒素可以明顯減少小麥田雜草小子虉草(Phalaris minor L.)和齒果酸模(Rumex dentatus L.)的根莖長度和生物量;Phattanawasin［15］發(fā)現(xiàn)費(fèi)希爾曲霉(Aspergillus fischeri TISTR 3272)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對刺軸含羞草(Mimosa pigra)和稗草(Echinochloa crus-galli)的胚根和芽長抑制率達(dá)到80%以上;王靜［16］從紫莖澤蘭內(nèi)生菌中提取的粗毒素對油菜和高粱胚根、胚芽的伸長有較強(qiáng)的抑制作用;Dor［17］發(fā)現(xiàn) Fusarium oxysporum f.sp.orthoceras的發(fā)酵濾液產(chǎn)生的鐮刀菌酸和9，10-dehydrofusaric acid(DFA)能引起 Helianthus annuus、Orobanche cuman、Sonchus oleraceus植株失綠和萎蔫。本研究從發(fā)病的刺兒菜葉中分離得到HL-1菌株，其發(fā)酵濾液對試驗(yàn)靶標(biāo)雜草幼苗具有不同程度的致死作用，對豬殃殃和藜具有很強(qiáng)的致病性，噴施于植株后可導(dǎo)致其葉片發(fā)黃枯萎甚至整株枯死。

植物內(nèi)生真菌開發(fā)成為微生物除草劑，多數(shù)是利用它們的次生代謝生物，在應(yīng)用時(shí)首先應(yīng)該考慮的是對作物不致病。菌株HL-1從自然發(fā)病的刺兒菜葉上分離獲得，代謝產(chǎn)物對春小麥和蠶豆很安全，雖可使油菜和青稞幼苗感病，但只產(chǎn)生斑點(diǎn)型病害，病斑不擴(kuò)散，不影響青稞、蠶豆后期生長，但對豌豆植株株高有輕微的抑制作用。可見，該菌的代謝產(chǎn)物對多數(shù)雜草有抑制作用的同時(shí)對作物相對安全，可以在以豬殃殃和藜為優(yōu)勢雜草的春小麥和蠶豆田中安全使用。

利用微生物代謝產(chǎn)物開發(fā)的微生物源除草劑既有化學(xué)農(nóng)藥易加工、使用方便的特點(diǎn)，又有生物農(nóng)藥安全易降解的特性。此外，還可以對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行提純和結(jié)構(gòu)鑒定，通過仿生合成等途徑開發(fā)新型除草劑。因此，內(nèi)生真菌HL-1菌株代謝產(chǎn)物的應(yīng)用前景很大，可進(jìn)一步加強(qiáng)有關(guān)制劑開發(fā)及活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定。

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