邱厚匡，姚亞超，李 磊，李亞紅，張 珍，李 楠，嚴(yán) 芳，李澤泳，吳春燕，吳曉昀，張 智△(.廣東省第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣州 5037；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣州 5050)

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·論 著·

EB病毒抗體及其DNA聯(lián)合檢測在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價值*

邱厚匡1，姚亞超1，李 磊2，李亞紅1，張 珍1，李 楠1，嚴(yán) 芳1，李澤泳1，吳春燕1，吳曉昀1，張 智1△(1.廣東省第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣州 510150)

目的 探討EB病毒(EBV)抗體及EBV DNA聯(lián)合檢測在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價值。方法 收集2011年7月至2014年8月廣東省第二人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的鼻咽癌患者272例，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血清RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定血漿EBV-DNA。結(jié)果 四項指標(biāo)聯(lián)合檢測時，其敏感度最高(99.63%)；早期鼻咽癌的陽性率為97.62% (41/42)，晚期鼻咽癌的陽性率為100.00% (230/230)。四項指標(biāo)中任意兩項及兩項以上指標(biāo)為陽性的特異性在93.00%以上。結(jié)論 四項指標(biāo)聯(lián)合檢測可用于早期鼻咽癌的篩查，任意兩項以上指標(biāo)陽性時應(yīng)高度懷疑鼻咽癌。

鼻咽癌； EB病毒抗體； EBV DNA； 早期診斷

鼻咽癌(NPC)是侵襲性和轉(zhuǎn)移率最高的頭頸部惡性腫瘤，在中國華南和東南亞地區(qū)高發(fā)[1]，很多患者確診時已為晚期，預(yù)后較差[2]。早期鼻咽癌預(yù)后較好，但其位置隱蔽，早期癥狀不明顯，因此對鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人群進行篩查和早期診斷是治療鼻咽癌的關(guān)鍵[3]。大量研究表明EB病毒(EBV)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，EBV相關(guān)抗體和EBV DNA是目前診斷鼻咽癌的重要方法[5-6]。目前尚無聯(lián)合檢測RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA、EBV DNA對鼻咽癌早期診斷價值的報道。本研究旨在探討聯(lián)合檢測這四項指標(biāo)在鼻咽癌篩查和早期診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年7月至2014年8月廣東省第二人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的鼻咽癌患者272例，其中男195例，女77例；年齡21～80歲，中位年齡48歲。所有患者均按鼻咽癌臨床TNM分期法進行分期，Ⅰ、Ⅱ期為早期，Ⅲ、Ⅳ期為晚期，病理類型以非角化型癌為主，占93.38%(254/272)。

1.2 抗體檢測方法 抽取鼻咽癌患者治療前靜脈血5 mL。RTA-IgG抗體檢測采用北京同昕生物技術(shù)有限公司的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒，VCA-IgA和EA-IgA抗體檢測采用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司的ELISA試劑盒。嚴(yán)格按照上述試劑盒的說明書進行操作，RTA-IgG以S/CO≥1.0為陽性，VCA-IgA和EA-IgA均以S/CO≥1.1為陽性。

1.3 EBV DNA檢測方法 分離乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血血漿，DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測定EBV DNA，計算病毒拷貝數(shù)，檢測試劑購自湖南圣湘生物科技有限公司。EBV DNA>50 copy/mL記為陽性，低于檢測下限記為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EBV四項檢測指標(biāo)對鼻咽癌的診斷價值 單獨應(yīng)用一項指標(biāo)檢測鼻咽癌患者時，以VCA-IgA敏感度最高(96.32%)，EA-IgA特異性最高(94.68%)。見表1。四項指標(biāo)聯(lián)合檢測時，至少一項檢測結(jié)果為陽性者的敏感度最高(99.63%)，僅有1例鼻咽癌患者漏診。兩項指標(biāo)聯(lián)合檢測時，RTA-IgG和VCA-IgA均為陽性的約登指數(shù)最高(83.13%)，RTA-IgG和EA-IgA均為陽性的特異性最高(100.00%)。任意三項或四項檢測均為陽性的特異性也可達到100.00%。四項指標(biāo)中任意兩項及兩項以上指標(biāo)為陽性的特異性均在97.00%以上。見表2。

2.2 不同臨床分期鼻咽癌患者EBV檢測指標(biāo)陽性率比較 各期病例中RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA陽性率之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；EBV DNA陽性率在各鼻咽癌分期之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。單項檢測時，早期鼻咽癌患者中RTA-IgG和VCA-IgA的陽性率分別為85.71% (36/42)和88.10%(37/42)；晚期鼻咽癌患者中VCA-IgA的陽性率最高，可達到97.83%(225/230)。聯(lián)合檢測時，早期和晚期鼻咽癌中至少一項檢測結(jié)果為陽性的概率分別為97.62%(41/42)和100.00%(230/230)。見表3。

表1 EBV四項檢測指標(biāo)對鼻咽癌的診斷價值[%(n/n)]

表2 不同指標(biāo)聯(lián)合檢測對鼻咽癌的診斷價值

表3 不同臨床分期鼻咽癌患者EBV檢測指標(biāo)陽性率比較[%(n/n)]

3 討 論

大量研究表明EBV感染與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EBV相關(guān)抗體如RTA-IgG，VCA-IgA和EA-IgA等可作為鼻咽癌輔助診斷的血清學(xué)指標(biāo)[7-8]。此外，鼻咽癌患者血漿中存在高拷貝數(shù)的EBV DNA，且其水平變化與腫瘤發(fā)生、療效、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)相關(guān)[9]。血清學(xué)指標(biāo)改變和EBV DNA拷貝數(shù)的改變在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中是普遍和早期的事件，因此探討早期鼻咽癌血清學(xué)和EBV DNA改變情況，將有助于實現(xiàn)鼻咽癌的早期診斷，從而提高鼻咽癌治愈率。

本研究結(jié)果顯示，單項檢測RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA和EBV DNA時，其敏感度分別為87.50%、96.32%、57.35%和72.43%；RTA-IgG，VCA-IgA和EBV DNA的敏感度與以往報道一致，EA-IgA的敏感度與以往報道不一致[10-11]，分析原因可能是所用檢測方法、檢測試劑盒、陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的差異和納入人群的地域分布不一致等。本研究采用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司的ELISA試劑盒，而其他研究多采用中山生物工程公司的免疫酶法檢測試劑盒[11-14]。此外，單項檢測時以VCA-IgA的敏感度最高，EA-IgA的特異性最高，與羅耀凌等[14]報道的結(jié)果一致。

臨床分期是影響鼻咽癌預(yù)后的主要因素。RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA在鼻咽癌的各個臨床分期之間陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與以往報道一致[11]。提示這三項指標(biāo)不適用于判定鼻咽癌臨床分期。本研究中EBV DNA陽性率隨著臨床分期升高而增加，與以往報道一致[13]。在鼻咽癌早期，RTA-IgG或VCA-IgA單項指標(biāo)診斷鼻咽癌的陽性率相差不大，分別為85.71%和88.10%，但是尚不足以成為理想的鼻咽癌早期篩查的腫瘤血清學(xué)指標(biāo)。

RTA蛋白是EBV由潛伏期轉(zhuǎn)向裂解期的關(guān)鍵調(diào)控因子，它能引起一系列裂解早期基因的相繼表達，最終引發(fā)EBV裂解干擾[15-16]。VCA是在鼻咽癌增殖后期形成的結(jié)構(gòu)蛋白，是在感染EBV后最晚表達的一種抗原，可在體內(nèi)終生存在，有助于早期診斷鼻咽癌[7-8]。EA-IgA雖然也是鼻咽癌增殖后期形成的結(jié)構(gòu)蛋白，但是其刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況存在個體差異，所以其敏感度不高，但是卻有較高的特異性[7-8]。EBV DNA是反映腫瘤消長情況靈敏可靠的指標(biāo)，可用于鼻咽癌的診斷、療效評價和預(yù)后評價[9]。

近年來，國內(nèi)外有很多聯(lián)合檢測用于鼻咽癌篩查和診斷的報道，張玉等[17]認(rèn)為VCA-IgA和EA-IgA聯(lián)合檢測，在鼻咽癌血清學(xué)診斷中具有互補作用，但敏感度僅有84.85%；汪欣等[18]認(rèn)為，VCA-IgA、ZTA-IgA、NA1-IgA或者RTA-IgG、VCA-IgA、ZTA-IgA三項聯(lián)合檢測可使鼻咽癌檢出率達到100.00%。但該研究中鼻咽癌患者例數(shù)僅有20例，不能準(zhǔn)確反映這些指標(biāo)診斷鼻咽癌的真實情況。本研究中采用四項檢測指標(biāo)，既包括EBV相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答情況，又含有鼻咽癌時EBV自身增殖情況，檢測結(jié)果可以互補。研究結(jié)果顯示，僅有1例早期鼻咽癌漏診，早期鼻咽癌的陽性率可提高至97.62%(41/42)，晚期鼻咽癌的陽性率可達到100.00%，雖然其約登指數(shù)不高(58.14%)，但是可以提高臨床篩查的敏感度。

已知EA-IgA診斷鼻咽癌的特異性較高，此指標(biāo)陽性者鼻咽癌風(fēng)險非常大，與其他指標(biāo)同時陽性者的風(fēng)險更大。本研究兩項指標(biāo)檢測中RTA-IgG和EA-IgA均為陽性，任意三項或四項檢測均為陽性的特異性均可達到100.00%，出現(xiàn)上述檢測結(jié)果時應(yīng)該高度懷疑鼻咽癌。郭麗萍等[19]報道EBV RTA-IgG和VCA-IgA兩種抗體均為陽性者，可列為鼻咽癌高危人群。程偉民等[20]報道，EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和ZTA-IgG均為陽性的特異性可達到93.00%。本研究中比較了四項指標(biāo)中兩項及以上指標(biāo)的陽性率，與姜世強等[21]報道一致。DNA和VCA-IgA，以及EA-IgA和EBV DNA均為陽性時有較高的鼻咽癌診斷價值。本研究中任意兩項以上指標(biāo)為陽性時診斷鼻咽癌的特異性均在97.00%以上，可較以往報道獲得更高的特異性，可提高臨床診斷的準(zhǔn)確度。若臨床患者出現(xiàn)任意兩項以上指標(biāo)為陽性時，提示其鼻咽癌風(fēng)險非常高，應(yīng)高度懷疑鼻咽癌。

綜上所述，本研究所采用的四項指標(biāo)聯(lián)合檢測有互補作用，可用于鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人群的篩查和早期診斷，其中一項陽性者應(yīng)該定期復(fù)查體檢，以便提高早期無癥狀鼻咽癌檢出率；任意兩項以上指標(biāo)為陽性時，應(yīng)高度懷疑鼻咽癌，實現(xiàn)早期無癥狀鼻咽癌的準(zhǔn)確診斷。

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Combined determination of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for nasopharyngeal carcinoma early diagnosis*

QIUHou-kuang1，YAOYa-chao1，LILei2，LIYa-hong1，ZHAGNZhen1，LINan1，YANFang1，LIZe-yong1，WUChun-yan1，WUXiao-yun1，ZHANGZhi1△

(1.BiologicalExperimentCenter，theSecondPeople′sHospitalofGuangdongProvince，Guangzhou，Guangdong510317，China；2.DepartmentofReproductiveMedicineCenter/KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong510150，China)

Objective To evaluate the values of combined detection of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for diagnosing of early stage nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods A total of 272 NPC patients were recruited in this study from July 2011 to August 2014 in the Second People′s Hospital of Guangdong Province.Euzymelinked immunosorbent assay was performed to detect RTA-IgG，VCA-IgA and EA-IgA antibody,and real-time fluorescent quantitative PCR for measuring EBV DNA in plasma.Results The sensitivity of the combined detection for diagnosing NPC was 99.63%.Combined detection could improve the positive rate of diagnosis for early and late stage NPC to 97.62% (41/42) and 100.00%(230/230) respectively.The positive rate of any two or more indicators for NPC was above 93.00%.Conclusion Combined determination could be helpful to screen the early stage NPC，when people has any two or more positive indicators should be suspected to have NPC.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus antibody; EBV DNA; early diagnosis

國家自然科學(xué)基金項目(81400639)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金(2014C39)。

邱厚匡，男，本科，技師，主要從事分子生物學(xué)研究。

△通訊作者,E-mail：yalw135@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.001

A

1672-9455(2015)10-1339-03

2014-11-05

2015-01-15)