田玉彪，楊廣安,2,3，黃維杰，向仕珍，王慧娟,2,3， 周 英,2,3*　(.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開(kāi)發(fā)中心，貴州貴陽(yáng) 550025)

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HPLC測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量

田玉彪1，楊廣安1,2,3，黃維杰1，向仕珍1，王慧娟1,2,3， 周 英1,2,3*(1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開(kāi)發(fā)中心，貴州貴陽(yáng) 550025)

摘要[目的]建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。[方法]采用安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，柱溫30 ℃。[結(jié)果]松果菊苷和毛蕊花糖苷進(jìn)樣量分別在0.40～4.00、0.44～44.00 μg范圍內(nèi)均與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均回收率分別為97.4%和101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%。[結(jié)論]該方法簡(jiǎn)單可行、重現(xiàn)性好、精密度高、結(jié)果可靠，可用于同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

關(guān)鍵詞高效液相色譜法；肉蓯蓉微粉；松果菊苷；毛蕊花糖苷；含量測(cè)定

Determination on the Content of Echinacoside and Acteoside fromHerbaCistancheMicro Powder by HPLC

TIAN Yu-biao1,YANG Guang-an1,2,3,HUANG Wei-jie1,ZHOU Ying1,2,3*et al(1.College of Pharmacy,Guizhou University, Guiyang,Guizhou 550025;2.Guizhou Engineering Center for innovative Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine, Guiyang,Guizhou 550025;3.Guizhou Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources, Guiyang,Guizhou 550025)

Abstract[Objective] The research aimed to establish the HPLC method for determining the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.[Method]Agilent 1260 high performance liquid chromatograph and waters C18column(5 μm,4.6 mm×250 mm) were adopted.The mobile phase was mixture of methanol and 0.1% formic acid water solution gradient elution.The flow rate was 1 ml/min,the detection wavelength was 330 nm,the column temperature was 30 ℃.[Result]The linear ranges of echinacoside and acteoside were 0.40-4.00 and 0.44-44.00 μg respectively,the average recoveries were 97.4%(RSD=1.7%)and 101.3%(RSD=1.52%)respectively,RSDwere 1.70% and 1.52% respectively.[Conclusion] The method was simple and feasible, good reproducibility, high precision and reliable results.It can be used as quantitative determination for the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.

Key wordHPLC;HerbaCistanche;Echinacoside；Acteoside;Content determination

肉蓯蓉(HerbaCistanche)為列當(dāng)科(Oroban-chaceae)植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaMa)的帶鱗片的干燥肉質(zhì)莖,又名蓯蓉、大蕓、金筍、地精，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。其味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便功能[1]。目前，肉蓯蓉已分離出多種類型的物質(zhì),主要可分為苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿等[2-3]。藥理試驗(yàn)證實(shí)，肉蓯蓉中的苯乙醇總苷,類葉升麻苷均具有促性激素樣、雄激素樣及增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能等作用[4-6]。

在中藥浸出物制備過(guò)程中，合適粒度使得中藥指標(biāo)性成分最大限度的溶出,提高其釋放速度和利用率,中藥有效成分的浸出與擴(kuò)散面積(粉碎度)和擴(kuò)散時(shí)間有關(guān)[7-9]。在肉蓯蓉含量測(cè)定方面,張思巨等[10]建立HPLC同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉藥材中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的方法,并測(cè)定野生藥材的含量；王長(zhǎng)林等[11]采用HPLC法分析不同生長(zhǎng)周期、不同部位管花肉蓯蓉中松果菊苷的指紋圖譜。目前，對(duì)肉蓯蓉微粉的研究較少，該試驗(yàn)對(duì)肉蓯蓉藥材進(jìn)行微粉化處理，以其質(zhì)量控制作為研究目標(biāo)，參照2010版《中國(guó)藥典》，采用HPLC同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，以期為中藥材生產(chǎn)加工節(jié)省中藥資源、減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)、降低設(shè)備投資、縮短生產(chǎn)周期。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1311C輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314F-VWD紫外檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站。FA2004 型電子分析天平( 上海良平儀器有限公司) ，超微粉碎機(jī)(濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司)，超聲儀(KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.1.2藥材及試劑。收集到6批肉蓯蓉樣品，經(jīng)貴州大學(xué)貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心鑒定為肉蓯蓉，超微粉碎機(jī)粉碎，過(guò)400目篩，放置干燥器備用。松果菊苷(批號(hào)111670-201304)及毛蕊花糖苷(批號(hào)111503-201411)對(duì)照品，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇(ACS,Reag.Ph Eur)，自制高純水。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。取松果菊苷及毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成每1 ml含松果菊苷0.20 mg和毛蕊花糖苷0.22 mg的混合對(duì)照品溶液，避光，4 ℃環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2供試品溶液的制備。取供試品粉末(過(guò)400目篩)約1 g，精密稱定，置100 ml棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，搖勻，稱定重量，浸泡30 min，超聲處理40 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

1.2.3色譜條件。采用安捷倫1260高效液相色譜儀和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1314F-VWD紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；流動(dòng)相為甲醇與0.1%甲酸水溶液，按不同比例混合(0～17 min：26.5∶73.5,17～25 min：29.5∶70.5,25～40 min：29.5∶70.5,)；進(jìn)樣量10 μl，流速1 ml/min，柱溫30 ℃，理論板數(shù)按松果菊苷、毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1線性關(guān)系考察。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10、20 μl，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，在“1.2.3”色譜條件下測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)x、峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析。

1.2.4.2精密度試驗(yàn)。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μl，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.2”方法制備供試溶液，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，精密吸取供試溶液10 μl，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.2”方法制備供試溶液,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，每隔4 h精密吸取供試溶液10 μl，按“1.2.3”色譜條件分別于0、4、8、12、20、24 h連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.5回收率試驗(yàn)。精密稱取6份已知含量的樣品各0.5 g，分別精密加毛蕊花糖苷及松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“1.2.2”方法制備溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的量及回收率。

1.2.5樣品含量測(cè)定。精密稱取6批次肉蓯蓉樣品各3份，每份1 g，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算毛蕊花糖苷及松果菊苷的含量，數(shù)據(jù)的表示方法為x±SD。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系。按“1.2.4.1”方法操作，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示松果菊苷和毛蕊花糖苷的線性回歸方程分別為y=1 312.3x+24.944(R2=1.000 0)、y=1 554.0x+33.02(R2=0.999 9)，表明松果菊苷和毛蕊花糖苷分別在0.40～4.00、0.44～4.40 μg的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.2”方法操作，計(jì)算得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分別為0.29%和0.49%，表明儀器精密度試驗(yàn)合格。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，測(cè)得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分別為0.82%和0.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，根據(jù)峰面積計(jì)算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD分別為1.75%和1.90%,表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5回收率試驗(yàn)。由表1可見(jiàn)，該方法測(cè)定肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的平均回收率分別為97.4%、101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量測(cè)定。

表1　肉蓯蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷回收率

2.2不同批次肉蓯蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量由表2可知，不同收集批次肉蓯蓉中松果菊苷含量最大的為17.8 mg/g、最小的為13.6 mg/g，毛蕊花糖苷含量最大的為12.3 mg/g、最小的為8.2 mg/g，說(shuō)明不同收集批次肉蓯蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量有較大的差異?？梢?jiàn)，肉蓯蓉藥材質(zhì)量因植株個(gè)體情況存在明顯的差異。從圖1可看出，松果菊苷及毛蕊花糖苷的分離度均較好，在“1.2.3”色譜條件下，樣品分離良好；混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為17.44、34.84 min，在樣品溶液色譜峰中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為17.43、35.04 min。由于受運(yùn)行時(shí)間或沖洗時(shí)間的影響，樣品松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品不完全一致，但在誤差允許的范圍內(nèi)。

3討論

近年對(duì)肉蓯蓉的研究報(bào)道文獻(xiàn)較多，但對(duì)肉蓯蓉微粉化的研究報(bào)道甚少，該試驗(yàn)參照2010版《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其微粉化進(jìn)行研究，以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其微粉化中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量及其穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷進(jìn)樣量分別在0.40~4.00、0.44~44.00 μg范圍內(nèi)均與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均回收率分別為97.4%和101.3%，RSD分別為1.70%、1.52%。該方法簡(jiǎn)單可行、重現(xiàn)性好、精密度高、結(jié)果可靠，可用于同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

表2不同收集批次肉蓯蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果

該試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉中毛蕊花糖苷在常溫下放置容易變質(zhì)，配制好的儲(chǔ)備液應(yīng)盡快使用，同時(shí)于陰涼避光處儲(chǔ)存。

通過(guò)對(duì)原生藥材進(jìn)行超細(xì)粉碎,可以得到更加適合于機(jī)體吸收、利用的微粉藥材,從而大大提高原生藥材的生物利用度和其治療效果，因此用微粉提高肉蓯蓉的利用率是一個(gè)行而有效的辦法[12]，肉蓯蓉微粉化研究為其微粉化制劑的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用肉蓯蓉資源以及深入挖掘其在食品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的參考價(jià)值，對(duì)企業(yè)中藥材加工有一定的指導(dǎo)意義。

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收稿日期2015-10-19

作者簡(jiǎn)介田玉彪(1993-)，男，山東菏澤人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事天然藥物的活性研究。

基金項(xiàng)目貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)資金(黔科合人字2011(34)號(hào))；貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心(黔教科合KY字[2012]018號(hào))；貴州省藥食同源植物資源研究開(kāi)發(fā)中心(黔科合G字[2014]4003號(hào))；貴州大學(xué)大學(xué)生“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目(貴大SRT字(2014)099號(hào))。

中圖分類號(hào)S 567

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)33-171-03