戴小宇，朱 海，張曉冬，張曉芳，宗 英，戴益民，張淑英，袁伯俊，陸國才（第二軍醫(yī)大學藥物安全性評價中心，上海200433）

纖維蛋白封閉劑對SD大鼠連續(xù)腹腔注射給藥14天的毒性研究

戴小宇，朱 海，張曉冬，張曉芳，宗 英，戴益民，張淑英，袁伯俊，陸國才（第二軍醫(yī)大學藥物安全性評價中心，上海200433）

目的評價SD大鼠連續(xù)腹腔注射纖維蛋白封閉劑的安全性。方法SD大鼠雌雄分別按體質量隨機分4組，即空白對照組、纖維蛋白封閉劑低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，雌雄各半。3個給藥組的給藥劑量分別為85.5、171.0和342.0mg／kg，每天腹腔注射給藥，連續(xù)14 d，恢復期28 d，進行一般癥狀、血液學、血液生化和病理組織學等指標檢測。結果與空白對照組相比，纖維蛋白封閉劑中、高劑量組大鼠第14天的白細胞計數顯著升高，纖維蛋白原顯著降低，中、高劑量組大鼠脾臟的臟器重量有增加趨勢。組織病理學檢查發(fā)現部分高劑量動物腹腔出現殘留藥物引起的纖維肉芽組織包裹。上述變化指標在恢復期結束時基本可恢復。結論大鼠腹腔注射纖維蛋白封閉劑85.5～342.0 mg／kg，安全劑量為85.5 mg／kg，毒性劑量為171.0mg／kg。毒性靶系統或靶部位為血液系統、免疫系統和給藥局部，毒性作用可逆。

纖維蛋白封閉劑；SD大鼠；重復給藥毒性；臨床前安全性

纖維蛋白封閉劑（fibrin sealant，FS）是一種新型的生物可降解的組織粘合劑和止血藥［1］，主要成分為纖維蛋白原和凝血酶，各組分混合后噴灑于創(chuàng)面形成纖維蛋白，促進血凝塊形成從而發(fā)揮止血作用，可用于外科手術后的止血和促進傷口愈合［2，3］，本研究通過腹腔注射重復給予SD大鼠豬源性FS，觀察FS對SD大鼠產生的毒性反應及嚴重程度、主要毒性靶器官及毒性損害的可逆程度，找到重復給藥毒性的安全劑量，為臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法［4-6］

1.1材料

1.1.1 藥物與試劑 纖維蛋白封閉劑（組分Ⅰ：纖維蛋白原，批號：20071101，規(guī)格：134.54 mg／瓶；組分Ⅰ溶解液，批號：20071101，規(guī)格：6 m l／瓶。組分Ⅱ：凝血酶，批號：20071101規(guī)格：893 IU／瓶；組分Ⅱ溶解液，批號：20071101，規(guī)格：6 m l／瓶）由上海利康生物工程有限公司提供，樣品2～8℃避光保存。血液學檢測試劑由西門子醫(yī)學診斷產品（上海）有限公司生產，血清生化檢測試劑購自復星長征醫(yī)學科學有限公司。

1.1.2 主要儀器 拜耳ADVIA2120血球分析儀（德國）、日立7080全自動生化分析儀（日本）、C2000-4型血凝分析儀（日本）、EasyLyte型鈉鉀氯電解質分析儀（美國）、OLYMPUS BX41型光學顯微鏡（日本）和OLYMPUS DP12數碼相機（日本）等。

1.1.3 動物 SPF級SD大鼠80只，6～8周齡，雌雄各半，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2003-0002。

1.2方法

1.2.1 劑量設計 根據大鼠藥效學最低有效劑量33.6 mg／kg，以及大鼠重復給藥毒性前期試驗結果提示大鼠可以耐受342 mg／kg劑量，且此劑量時的給藥濃度已達最適可配濃度，設低、中、高給藥劑量分別為85.5、171.0、342.0 mg／kg。

1.2.2 動物分組及給藥 動物分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房，5只／籠，自由攝食與飲水。動物房室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照周期12 h。經檢疫馴化7 d后，大鼠雌雄分別按體重隨機分成空白對照組、纖維蛋白封閉劑低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，雌雄各半。低、中、高劑量給藥組的給藥劑量分別為85.5、171.0和342.0 mg／kg，給藥體積均為15 m l／kg，相應的給藥濃度分別為5.7、11.4和22.8 mg／m l?？瞻讓φ战M腹腔注射15 m l／kg生理鹽水。連續(xù)給藥14 d，恢復期28 d。

1.2.3 觀察指標 每天觀察和記錄動物的活動及精神狀況，皮毛和糞便的顏色及是否成形等。體質量每周稱一次，根據體質量增長更新給藥量，計算出每組動物的平均體質量，觀察體質量增長的動態(tài)變化。食量每天稱一次，算出每周每組動物的平均食量，觀察其動態(tài)變化。分別在給藥結束（第14天）和恢復期結束（第42天），各組均取10只大鼠（雌雄各半）靜脈注射2%戊巴比妥鈉麻醉，經腹主動脈采血，進行血液生化指標和血液學指標檢測。血液學指標包括紅細胞（RBC）計數、血紅蛋白（HGB）定量、血細胞比容（HCT）、紅細胞平均容積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白容量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數（PLAT）、白細胞（WBC）計數和白細胞分類［中性粒細胞比例（NEUT%）、淋巴細胞比例（LYMPH%）、單核細胞比例（MONO%）、嗜酸性粒細胞比例（EOS%）和嗜堿性粒細胞比例（BOS%）］、網織紅細胞（RET）計數、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和血漿纖維蛋白原（FIB）。血液生化指標包括血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、總膽紅素（TBI）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、總蛋白（TP）、白蛋白（A lb）、血糖（Glu）、總膽固醇（Tch）、三酰甘油（TG）、肌酸磷酸激酶（CPK）、血清鈣（Ca）和血清磷（P）、血清鉀（K）、血清鈉（Na）和血清氯（Cl）。第14天及第42天各組麻醉大鼠完全放血安樂死后進行剖檢，按《化學藥長期毒性試驗指導原則》要求摘取臟器，固定后進行組織切片，HE染色后進行病理組織學檢查。股骨骨髓涂片后進行骨髓細胞學檢查，對心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢質量進行測量并計算相對質量。

1.2.4 數據統計與處理 對于體質量、攝食量、血液學指標及血清生化檢查指標等計量資料，均按照以下方法統計：①首先進行正態(tài)性檢驗；②如果資料符合正態(tài)性（檢驗P＞0.05），則進行方差齊性分析，如果數據方差齊性，則進行方差分析檢驗（F檢驗）。如果方差分析檢驗結果顯著（P≤0.05），則進一步用LSD-t、Dunett-t參數檢驗法進行多重比較檢驗；如果方差分析結果不顯著（P＞0.05），則統計結束。③如果數據方差不齊性，則進行Dunett-T3參數檢驗法進行多重比較檢驗。④如果資料不符合正態(tài)性，則進行K ruskal-Wallis檢驗（H檢驗）和Median檢驗。如果K ruskal-Wallis檢驗結果顯著（P≤0.05），則進一步用非參數檢驗法進行兩兩比較檢驗；如果K ruskal-Wallis檢驗結果不顯著，則統計結束。對于臟器病理變化比例等計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1一般狀況 試驗期間，各劑量組大鼠一般行為、活動、毛發(fā)、大小便與對照組相比未見明顯異常。

2.2體重、攝食量 與空白對照組相比，相同時間點給藥組大鼠的體質量和攝食量未見與藥物相關的明顯變化。

2.3血液學指標 與空白對照組相比，中、高劑量給藥組大鼠第14天的WBC顯著升高，FIB顯著降低。上述指標顯現一定的劑量依賴性。其余部分指標雖有統計學差異，但均在正常范圍內波動。結果見表1。

表1 纖維蛋白封閉劑腹腔注射對大鼠血液學指標的影響（n＝10，ˉx±s）

2.4血清生化指標 與空白對照組相比，各給藥組大鼠第14天及第42天檢測的生化指標無明顯差異，表明受試物對ALT、AST、ALP、TBI、BUN、Cr、TP、A lb、Glu、Tch、LDH、CPK、TG、K、Na和Cl無明顯影響。

2.5骨髓細胞檢查 骨髓涂片結果顯示，粒細胞系統、紅細胞系統、巨核細胞系統、淋巴細胞及單核細胞系統均未見異常增生。

2.6對臟器重量的影響 臟器稱重結果顯示，第14天時大鼠脾臟重量有劑量依賴性升高趨勢，第42天時基本能恢復。其余臟器未見明顯影響。

表2 纖維蛋白封閉劑腹腔注射對大鼠脾臟絕對質量的影響（n＝10，ˉx±s，g）

2.7病理學檢查 病理組織學檢查發(fā)現給藥結束時中、高劑量組大鼠脾臟淋巴細胞增生；部分高劑量組動物的腹腔臟層腹膜組織，肉眼或鏡下查見有注入的藥劑殘留誘發(fā)的瘤樣隆起病灶，最大的直徑達1.2 cm，單發(fā)或多灶散在，灰白色。鏡下觀察病灶外裹厚層的增生纖維結締組織，中心可見粉染的大量無定形膠樣固態(tài)物（殘留藥物）。個別高劑量組大鼠病灶內還混有中性粒細胞（圖1～3）?；謴推诮Y束時各組大鼠未見藥物相關的器質性病變。

3 討論

局部止血藥已在國外被廣泛使用，但有臨床報道手術中局部止血藥殘留會增加術后不良反應的發(fā)生，同時增加了術后CT、MRI 等影像學對于術后恢復診斷的難度，甚至會把殘留的止血藥誤診為腫瘤或膿腫［7-9］。因此手術過程中應盡可能避免使用過多的局部止血藥。

圖1 空白對照組SD大鼠第14天腸系膜組織結構（HE，×100）

圖2 高劑量組SD大鼠第14天腸系膜組織結構（HE，×100）

本研究中的受試物纖維蛋白封閉劑是豬源的蛋白分子復合制劑，主要由凝血酶與纖維蛋白組成。凝血酶與纖維蛋白獨立分裝于Y型針管中的2個臂中，給藥時，二組份于Y型針管的共同管道內混合并發(fā)生酶催化反應，到達給藥部位表面時可快速凝固，并達到止血的目的。隨著此類藥物的臨床應用越來越普遍，其安全性也越來越受到人們的關注［10］。

圖3 高劑量組SD大鼠第14天臟層腹膜組織結構（HE，×100）

本研究血液學指標發(fā)現高劑量組大鼠的WBC與空白對照組相比顯著升高，可能與未完全吸收的藥劑殘留物在腹腔內引起炎癥反應，形成纖維肉芽組織，并對大鼠腹腔局部具有一定刺激作用有關。表明給藥劑量較高時，藥物對給藥部位存在一定的刺激性。

中、高劑量組大鼠纖維蛋白在第14天與對照組相比顯著降低，脾臟絕對質量和相對質量有增加趨勢，病理組織學檢查發(fā)現中、高劑量組大鼠脾臟淋巴細胞增生，提示纖維蛋白封閉劑可能對動物的免疫系統有一定影響。

第14天變化的指標在恢復期結束時基本恢復，并且病理組織學觀察中脾臟未見明顯異常，表明藥物的毒性作用較輕且可逆。

因此，纖維蛋白封閉劑85.5～342.0 mg／kg連續(xù)腹腔注射大鼠14 d，安全劑量為85.5 mg／kg， 171.0 mg／kg劑量以上時可致血液系統的WBC增加、纖維蛋白減少、脾臟質量增加，藥物也不能完全被吸收，藥劑殘留物在腹腔內可能會導致纖維肉芽組織形成，但上述毒性作用均可逆。臨床使用時應注意藥物較高劑量使用時對毒性靶部位血液系統、免疫系統和給藥局部可能存在的影響，避免發(fā)生術后不良反應。

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Repeat-dose toxicity study of fibrin sealant in SD rats

DAIXiaoyu，ZHU Hai，ZHANG Xiaodong，ZHANG Xiaofang，ZONG Ying，DAIYimin，ZHANG Shuying，YUAN Bojun，LU Guocai（Center for New Drug Evaluation，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo evaluate the safety of fibrin sealant（FS）intraperitoneal injection in SD rats.Methods80male and female SD rats were random ly divided into four groups（0，85.5，171.0，342.0mg／kg）by body weight.A ll ratswere intraperitoneally injected w ith vehicle or FS daily for 14 days followed by a 28-day recovery period.The clinical signs，hematological and biochem ical indices weremeasured.The pathology were observed.ResultsIncrease of white blood cell count（WBC）and decrease of fibrinogen（FIB）in d 14 were found in 171.0mg／kg and 342.0mg／kg dosage groups.Furthermore，the tendency of weight increase of spleen were found in 171.0mg／kg and 342.0mg／kg dosage groups.Pathologicalexams of peritoneal cavity found that there were granulation tissues containing FS in some of the rats in 342.0 mg／kg group.A ll of these changes got reversed after the recovery period.ConclusionThe safety dose in this study is considered to be 85.5mg／kg，and the toxicity dose is 171.0mg／kg.The target toxicity systems or siteof FS in SD rats are hematological system，immune system and injection site.The toxic effects of FS are reversible.

fibrin sealant；SD rats；repeat-dose toxicity；preclinical safety

R965

］ A

1006-0111（2015）03-0231-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.010

2014-08-27

2014-12-30

［本文編輯］ 陳 靜

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2014ZX09J14106）；上海市公共衛(wèi)生重點實驗室建設計劃（12GWZX0501）；上海市自然科學基金（13ZR1449400）

戴小宇，碩士研究生.研究方向：新藥臨床前安全性評價.Tel：（021）81871035；E-mail：littlefishdai＠163.com

陸國才，博士生導師，教授.研究方向：新藥臨床前安全性評價.Tel：（021）81871032；E-mail：new drug＠smmu.edu.cn