趙雪竹，劉 洋，王艷萍，劉福強，張 琦，劉 丹，趙 楠，韓 丹，趙慶蘭（1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉1000；.沈陽軍區(qū)長春干休所，吉林長春10000；.解放軍08醫(yī)院，吉林長春1006）

原料純度對白及多糖疏水改性反應(yīng)取代度的影響

趙雪竹1，3，劉 洋2，王艷萍3，劉福強3，張 琦3，劉 丹3，趙 楠3，韓 丹3，趙慶蘭1，3（1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133000；2.沈陽軍區(qū)長春干休所，吉林長春130000；3.解放軍208醫(yī)院，吉林長春130062）

目的通過純化反應(yīng)原料之一膽甾醇琥珀酸酯（CHS），提高疏水改性白及多糖的膽甾醇基取代度。方法利用重結(jié)晶法純化CHS，并采用差示量熱掃描法（DSC）及X射線衍射法（XRD）對CHS純品進行表征；用高效液相色譜法（HPLC）測定純化前后產(chǎn)品中游離膽甾醇的含量；1H-NMR法測定CHS純化前后改性白及多糖的膽甾醇基取代度。結(jié)果重結(jié)晶后的CHS純度較高，具有晶體性質(zhì)，可明顯提高改性白及多糖的膽甾醇基取代度。結(jié)論純化方法簡便、可行，為提高改性白及多糖膽甾醇基取代度提供研究基礎(chǔ)。

原料純度；膽甾醇琥珀酸酯；取代度

可具有載藥、增溶、緩釋等功能，是目前國內(nèi)外的研究熱點［2，3］。疏水改性反應(yīng)中膽甾醇基取代度對納米粒的功能影響甚大，而影響取代度的因素較多，主要是反應(yīng)物即原料的純度，本試驗先是純化CHS，并對其純品進行表征，利用HPLC法測定純化前后產(chǎn)品中游離膽甾醇的含量；再利用1H-NMR法測定CHS純化前后改性白及多糖的膽甾醇基取代度。

1 儀器與材料

1.1儀器 79-1型磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；ZK-82B型真空干燥器箱（上海實驗儀器總廠）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器有限公司）；400 MHz液態(tài)核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；LC-10AVT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Pyris Diamond TG／DTA熱重／差熱綜合熱分析儀（美國PE公司）；D8-ADVANCE廣角X射線衍射儀（德國BRUKER公司）。

1.2試劑 白及多糖（實驗室自制）；膽甾醇（上?；菔郎苿┯邢薰荆荤晁狒ㄌ旖蚴泄鈴?fù)精細化工研究所）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶（上海展云化工有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1白及多糖疏水改性的過程［4］

2.1.1 膽甾醇琥珀酸酯的合成 取膽甾醇和琥珀酸酐各10 g溶解于140 m l除水吡啶中，室溫反應(yīng)72 h后終止反應(yīng)，反應(yīng)液滴入冰鹽酸溶液（鹽酸-冰-水＝12∶40∶50）中，析出白色絮狀沉淀。冷藏過夜，抽濾，收集沉淀。沉淀用蒸餾水洗至pH＞5，于乙酸乙酯-乙醇（3∶1）中重結(jié)晶，真空干燥，得白色針狀膽甾醇琥珀酸酯（CHS）純品。反應(yīng)式見圖1。

2.1.2 膽甾醇琥珀?；?白及多糖的合成 取白及多糖樣品0.5 g溶解于50 m l二甲基亞砜（DMSO）中，備用；取一定量的膽甾醇琥珀酸酯（CHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）［EDC／CHS＝1.2（mol／mol，催化劑）］、4-二甲氨基吡啶（DMAP）［DMAP／CHS＝1（mol／mol，催化劑）］，溶解于20 m l的DMSO（溶媒）中，室溫攪拌，反應(yīng)活化2 h；將活化反應(yīng)液滴入白及多糖溶液中，反應(yīng)48 h，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液滴入500m l無水乙醇中，析出白色沉淀，抽濾，分別用適量的乙醇、四氫呋喃和乙醚洗滌產(chǎn)物，80℃下真空干燥，即得膽甾醇琥珀酰基-白及多糖（CHSB）。改變CHS的用量，可制備不同取代度的CHSB。反應(yīng)式見圖2。

圖1 膽甾醇琥珀酸酯（CHS）的合成路線

圖2 琥珀酰膽甾醇基白及多糖（CHSB）的合成路線（R＝CHS）

2.2CHSB膽甾醇基取代度的測定 根據(jù)文獻，膽甾醇基取代度常用的測定方法有硫酸鐵銨比色法［5］、HPLC法［6］及1H-NMR法［5，6］，但考慮到硫酸鐵銨比色法、HPLC法在前處理過程中不能保證全部的膽甾醇從白及多糖主鏈上脫離下來，測定的是脫離下來的游離膽甾醇，測定結(jié)果存在一定誤差，而1H-NMR法是對膽甾醇琥珀酰基-白及多糖進行全分子掃描，測定結(jié)果準確度較高，故本研究所列的取代度均為1H-NMR法測定獲得的數(shù)值。

稱取5～10 mg CHSB樣品用氘代氯仿（CDCl3）溶解后加入核磁管中，采用400 MHz液態(tài)核磁共振波譜儀測定樣品核磁共振氫譜。由于白及多糖特征峰（δ／10－6）：δ5.36［H（1，6）］和δ4.62［H（1，4）］容易分辨，如圖3；CHSB圖譜中δ2.61（－OCH2CH2O－）容易分辨，如圖4，故可用峰面積（A）比值來計算膽甾醇在白及多糖上的取代度，通過公式（1）［7］計算樣品膽甾醇基取代度（DS）。DS%＝［（Aδ2.61／4）／（Aδ5.36＋Aδ4.62）］×100%（1）

Aδ2.61，CHSB核磁共振圖譜中δ2.61處的峰面積；Aδ5.36，白及多糖核磁共振圖譜中δ5.36處的峰面積；Aδ4.62，白及多糖核磁共振圖譜中δ4.62處的峰面積。

圖3 白及多糖核磁共振圖譜

圖4 CHSB核磁共振圖譜

2.3反應(yīng)物（原料）的純化

2.3.1 白及多糖的純化 白及多糖在提取過程中經(jīng)過了脫脂、醇沉、脫蛋白等純化處理，純度較高，且通過試驗證明重復(fù)上述純化步驟并沒有對樣品取代度有顯著影響，故對白及多糖的純化方法在此不做討論。

2.3.2 CHS的純化方法 本試驗采用重結(jié)晶法對CHS粗品進行純化：稱取一定量CHS粗品，加入適量的乙酸乙酯-乙醇（3∶1，V／V），冷凝回流加熱至沸騰，趁熱過濾。冷卻濾液，析出晶體。抽濾，濾餅真空干燥，即得白色針狀CHS純品。

2.3.3 CHS的純化結(jié)果

2.3.3.1 結(jié)晶產(chǎn)率（Y） 結(jié)晶產(chǎn)率通過公式2進行計算。結(jié)晶產(chǎn)率為45.23%。

m1，重結(jié)晶前CHS的質(zhì)量（g）；m2，重結(jié)晶后CHS的質(zhì)量（g）。

2.3.3.2 純化前、后CHS狀態(tài) 圖5、圖6為純化前、后CHS照片?？梢?，純化前CHS肉眼觀察為白色固體（圖5），而重結(jié)晶后CHS鏡下觀察為白色針狀晶體（圖6）。

圖5 純化前CHS狀態(tài)

圖6 純化后CHS狀態(tài)（EM，×100）

2.3.3.3 CHS的DSC分析［8］重結(jié)晶后的CHS具有晶體性質(zhì)，采用差示量熱掃描法進行樣品分析，儀器使用前用銦校正，在氮氣保護下測定樣品。每次取樣4～6 mg，以10℃／min升溫，加熱樣品至200℃，記錄樣品DSC曲線。見圖7。

圖7 樣品DSC曲線

由圖7可以看出，CHS為小分子結(jié)晶物質(zhì)，在120℃左右出現(xiàn)尖銳的熔點吸熱峰，說明重結(jié)晶后CHS純度較高。

2.3.3.4 CHS的X射線衍射（XRD）表征 稱取少量CHS置于樣品板，采用X射線衍射儀測定樣品的X射線晶體衍射圖譜。檢測條件：Cu靶；檢測波長：0.154 nm。見圖8。

圖8 CHS的X射線晶體衍射圖譜

由圖8可見，CHS為小分子結(jié)晶物質(zhì)，具有良好的晶型，故其X射線晶體衍射圖譜出現(xiàn)較多的晶體衍射峰，分別在2θ為6.38°、1.52°、14.40°、15.43°、16.83°、19.10°、20.98°、23.32°出現(xiàn)8個特征峰，在25°～45°間還分布許多小晶體峰。與DSC分析結(jié)果相互驗證，說明重結(jié)晶后的CHS具有晶體性質(zhì)。

2.3.3.5 CHS純化前、后產(chǎn)品中游離膽甾醇含量測定 采用高效液相色譜法測定：色譜條件為Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫為30℃；流動相為色譜純甲醇；流速為1 m l／min；檢測波長為202 nm。

精密稱取膽甾醇對照品適量，甲醇溶解，配制成1 mg／m l的對照品儲備液。精密量取一定量的儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg／m l的膽甾醇對照品溶液，分別取20μl用高效液相色譜儀進行測定，以膽甾醇峰面積（A）為縱坐標，膽甾醇質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為A＝4.0× 106C＋49 414（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，線性范圍為0.1～1.0 mg／m l。

精密稱取純化前、后的CHS產(chǎn)品各10 mg，加入2 m l色譜純甲醇，超聲振蕩溶解，離心，取上清液20μl進樣，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積。代入標準曲線，計算產(chǎn)品中游離膽甾醇含量。結(jié)果見表1。從表1中可以看出，純化后產(chǎn)品中游離膽甾醇含量明顯降低，表明產(chǎn)品純度提高，符合下一步合成

表1 CHS純化前、后產(chǎn)品中游離膽甾醇含量（mg／10 mg）

CHSB的需要。

2.3.4 CHS純化前、后改性白及多糖的膽甾醇基取代度對比 分別用純化前、后的CHS合成

CHSB，并改變白及多糖與CHS的投料比，制備不同取代度的CHSB，標記為CHSB1、CHSB2、

CHSB3。采用1H-NMR法測定其取代度，結(jié)果見表

2及圖9～圖11。

表2 CHS純化前、后CHSB樣品的膽甾醇基取代度對比（%）

圖9 CHS純化前（A）、純化后（B）同一投料比（10∶4，mol／mol）合成的CHSB1核磁共振圖譜

圖10 CHS純化前（A）、純化后（B）同一投料比（10∶6，mol／mol）合成的CHSB2核磁共振圖譜

圖11 CHS純化前（A）、純化后（B）同一投料比（10∶8，mol／mol）合成的CHSB3核磁共振圖譜

3 討論

3.1重結(jié)晶CHS，可提高樣品膽甾醇基取代度，是因為增大了反應(yīng)物的濃度。在一定溫度下，對于某一反應(yīng)，反應(yīng)物中活化分子的百分數(shù)是一定的。增加反應(yīng)物濃度時，單位體積內(nèi)活化分子總數(shù)增多，因此能使單位時間內(nèi)反應(yīng)物分子發(fā)生有效碰撞機會增多，從而使反應(yīng)速率加快。這就是著名的質(zhì)量作用定律所表述的：化學(xué)反應(yīng)速率與反應(yīng)物的物質(zhì)的量濃度成正比［9］。

3.2反應(yīng)物間的相互接觸、碰撞是發(fā)生反應(yīng)的先決條件［9］，重結(jié)晶后的CHS與粗品相比，純度提高，與白及多糖分子的接觸機會增多，使反應(yīng)更加充分，樣品取代度有所提高。

3.3膽甾醇基取代度的大小直接影響改性白及多糖的載藥和進一步應(yīng)用，所以對其取代度的研究具有重要意義。本試驗采取的原料純化方法既簡便可行，又能提高樣品的取代度，為今后的試驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Effect of raw material purity on the degree of substitution of hydrophobically modified Bletilla striata polysaccharide

ZHAO Xuezhu1，3，LIU Yang2，WANG Yanping3，LIU Fuqiang3，ZHANG Qi3，LIU Dan3，ZHAO Nan3，HAN Dan3，ZHAO Qinglan1，3（1.School of Pharmacy，Yanbian University，Yanji 133000，China；2.Changchun Sanatorium for Retired Cadres，Shenyang M illitary Region，Changchun 130000，China；3.No.208 Hospital of PLA，Changchun 130062，China）

ObjectiveTo improve the degree of substitution of the cholesteryl by purifying cholesteryl succinyl ester（CHS），one of the raw materials.MethodsCHSwas purified by recrystallization，the pure CHS structurewas characterizate by differential scanning calorimetry（DSC）and X ray diffraction（XRD），the free cholesterol contentof the pureand crudewere determinated by high performance liquid chromatography（HPLC），the degree of substitution of the cholesterylwas determinated before and after the purified by1H-NMR.ResultCHSwas purer after recrystallization，w ith property of crystal，which could significantly improve the degreeof substitution of the cholesteryl.ConclusionThemethod of purification was simpleand feasible，which was the basis of improving hydrophobicallymodified Bletilla striata polysaccharide′s degree of substitution of the cholesteryl.

the purity of raw materials；cholesteryl succinyl ester；substitution degree白及多糖主要由β-1，4-甘露糖和β-1，4-葡萄糖組成［1］，結(jié)構(gòu)中含有豐富的活性羥基，具有親水性，引入疏水性的膽甾醇基，使其呈兩親性，繼而制備納米粒，

R94

A

1006-0111（2015）03-0221-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.008

2014-12-29

2015-01-20

［本文編輯］ 顧文華

國家自然科學(xué)基金項目（81173559）

趙雪竹，碩士研究生.Tel：15948230094；E-mail：xuezhu_20080808＠126.com

張 琦，博士，主管藥師.研究方向：藥學(xué)新技術(shù).Tel：（0431）86988187；E-mail：zqi8229＠126.com