張國慶，李 丹，王科兵（.解放軍69醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽400；.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海00433）

紙基-表面增強拉曼光譜法快速鑒別染色南五味子藥材

張國慶1，李 丹2，王科兵1（1.解放軍169醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽421002；2.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海200433）

目的采用紙基-表面增強拉曼光譜法（SERS）對染色南五味子進行快速鑒別。方法選用浸泡法制備的銀膠紙作為SERS基底，擦拭經(jīng)乙醇-水溶液潤濕的南五味子，銀膠紙立即進行SERS檢測；先后對銀溶膠的濃縮倍數(shù)、銀膠紙的SERS增強效果及穩(wěn)定性等因素進行考察。結(jié)果成功鑒別低濃度酸性紅、赤蘚紅染色的南五味子。結(jié)論紙基-SERS法可實現(xiàn)非法染色南五味子的快速、準確、無損的鑒別，有望應(yīng)用于快檢領(lǐng)域。

表面增強拉曼光譜；銀膠紙；南五味子；非法染色

南五味子（Kadsura longepedunculata Finet et Gagnep）俗稱紅木香、紫金藤、紫荊皮，是木蘭科植物華中五味子（Schisand ra sphenanthera Rehd et W ils）的干燥成熟果實［1］，可做藥用，植株可供觀賞。近年來，南五味子非法染色現(xiàn)象多有報道，不法商販選用顏色相近且便宜易得的染料進行染色摻偽以達到以次充好的目的，此現(xiàn)象嚴重危害患者的用藥安全。因此，盡快建立一種能快速、準確、簡便鑒別染色南五味子的方法很有必要。

目前，染色五味子的鑒別方法有外觀鑒別、薄層色譜法（TLC）［2-5］，高效液相色譜法（HPLC）及其聯(lián)用技術(shù)［2-5］、二級管陣列技術(shù)［5］及紫外光譜法（UV）［2］等。TLC法操作簡單，但僅適用于初步篩選；HPLC及其聯(lián)用技術(shù)法準確度高，但樣品前處理過程較為煩瑣，且藥材的基質(zhì)成分可能干擾檢測；近年來興起的表面增強拉曼光譜（SERS）技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，可實現(xiàn)色素快速、無損的鑒別［6-8］。筆者以染色南五味子為研究對象，選用浸泡法制備的銀膠紙作為SERS基底，成功鑒別了經(jīng)低濃度酸性紅和赤蘚紅染色的南五味子。先后對銀溶膠的濃縮倍數(shù)、銀膠紙的SERS增強效果及穩(wěn)定性等因素進行系統(tǒng)考察，以期建立染色南五味子的快速、準確、無損的鑒別方法。

1 儀器與試劑

1.1儀器 KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機；紫外分光光度計TU-1901（北京普析通用儀器有限責任公司）；蔡氏掃描電鏡（EVO MA-10，Germany）；i-Raman（BWS415，B＆W Tek，USA），激發(fā)波長為785 nm，分辨率為5 cm－1。

1.2試劑和樣品 硝酸銀、檸檬酸三鈉和無水乙醇為分析純（上海國藥集團化學試劑有限公司）；定量濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；純凈水；酸性紅、赤蘚紅和羅丹明6G（R6G）（阿拉丁試劑公司）；南五味子購于藥店（產(chǎn)地：陜西漢中）。

2 實驗部分

2.1染色南五味子的制備 精密稱取R6G、酸性紅和赤蘚紅粉末各3 mg，分別溶解于3 m l純凈水，振蕩溶解，即制得濃度為1 mg／m l的染料標準溶液，其余濃度溶液通過逐級稀釋獲得。取適量南五味子進行模擬染色，浸泡染色6 h后烘干待用。

2.2銀溶膠及銀膠紙的制備

2.2.1 銀溶膠的制備［9］精密稱取45 mg的硝酸銀，加入少量去離子水使其溶解，后移至250 m l的容量瓶中定容；不斷攪拌上述溶液并將其加熱至沸騰，量取5 m l濃度為1%的檸檬酸鈉溶液，逐滴加入到沸騰的硝酸銀溶液中，保持溶液沸騰并繼續(xù)加熱60 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫并置于棕色瓶中避光保存。

2.2.2 銀膠紙的制備 分別量取2、3、5 m l上述銀溶膠置離心管中，分別配平后離心10 min（8 000 r／min）；離心后分別移去1、2、4 m l的上清液，剩余銀溶膠超聲數(shù)分鐘，即可制得濃縮2倍、3倍、5倍的銀溶膠。取定量濾紙，將其浸泡于原始濃度及上述濃縮后的銀溶膠中，避光24 h后取出，于50℃烘箱中烘干待用。

2.3染料標準SERS譜的獲得 用移液槍移取1μl 0.1 mg／m l的R6G、酸性紅及赤蘚紅標準溶液，滴加于優(yōu)化過的銀膠紙上，對滴加區(qū)立即進行SERS檢測，即獲得染料的標準SERS譜。

2.4染色南五味子的SERS檢測 用移液槍移取25μl的乙醇-水混合溶液潤濕染色藥材表面數(shù)秒，用干燥的銀膠紙擦拭藥材的潤濕區(qū)域數(shù)秒，對單次擦拭后的銀膠紙立即進行SERS檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1SERS基底的制備及表征

3.1.1 銀溶膠的紫外表征 利用紫外-可見分光光度計測試上述新制備銀溶膠的吸收譜，結(jié)果見圖1。如圖所示在421 nm處呈現(xiàn)單個吸收峰，這是典型的銀溶膠的紫外吸收峰［10，11］，可推測銀納米粒子以球體為主，且粒徑在50 nm左右。

3.1.2 銀溶膠濃縮倍數(shù)對SERS增強效果的影響 取定量濾紙若干張，分別量取20 m l原始濃度、濃縮2倍、3倍、5倍的銀溶膠進行浸泡，避光24 h后取出，室溫干燥備用。選取0.1 mg／m l的R6G作為探針對銀膠紙的增強效果進行考察，取1μl該溶液點于新制的各銀膠紙上，對點樣區(qū)立即進行SERS檢測，選用1 511 cm－1處的特征峰強度［12］作為標準比較增強效果，將3次檢測的峰強的平均值做柱狀圖，如圖2所示。濃縮3倍的銀溶膠浸泡制得的銀膠紙增強效果最好；且濃縮倍數(shù)超過3倍時，增強效果有所減弱。

圖1 銀溶膠的紫外表征圖譜

圖2 1μl（1mg／m l）R6G在銀膠紙上增強效果比較圖

另外，采用下述公式估算銀膠紙的增強因子（EF）［13］：

其中，I表示1 511 cm－1處的拉曼峰強度，N表示沉積于基底上的R6G的分子數(shù)；下標R和S代表拉曼和SERS。用圖2的數(shù)據(jù)估算，銀膠紙的增強因子分別是1.9×102、3.1×102、8.4×102和7.7×102，可以看出濃縮3倍的銀溶膠制備基底時EF較高，因此，選擇濃縮3倍的銀溶膠進行銀膠紙的制備。

3.2銀膠紙保存穩(wěn)定性的考察 選取0.1 mg／m l的R6G作為探針考察儲存10 d銀膠紙的增強效果的變化，同樣取1μl該溶液點于浸泡濃縮3倍的銀溶膠所制得的銀膠紙上，點樣區(qū)立即進行SERS檢測。同樣選用1 511 cm－1處的特征峰強度作為標準比較（圖3），3次檢測的平均強度與存放時間（d）的關(guān)系如圖4所示：制備5 d內(nèi)的銀膠紙增強效果略有降低，但基本保持穩(wěn)定，因此新制的SERS基底在5 d內(nèi)使用較好。

3.3非法染色南五味子的鑒別 采用紙基-SERS法檢測市售南五味子，滴加25μl乙醇-水混合溶液潤濕藥材表面數(shù)秒，取銀膠紙擦拭后進行SERS檢測，檢測結(jié)果見圖5?？瞻足y膠紙的光譜與市售藥材的擦拭檢測光譜幾乎完全相同，且未見后述的染料特征峰，說明南五味子未被后述染料染色。0.1 mg／m l的赤蘚紅及酸性紅的標準SERS譜見圖6。用OPUS軟件進行特征峰的標示后發(fā)現(xiàn)赤蘚紅在409、472、766、1 165、1 239、1 274、1 327、1 611 cm－1等多處存在特征峰；隨后進行模擬染色南五味子的擦拭檢測，染色樣品的擦拭檢測圖譜（圖7）在437、469、1 165、1 239、1 274、1 611 cm－1等多處也存在赤蘚紅的特征峰，可見該法可快速判別赤蘚紅染色的南五味子；隨后，檢測1、0.1、0.05 mg／m l酸性紅染色的南五味子，結(jié)果見圖8。分析步驟同上，通過比較酸性紅標準SERS譜及染色樣品的擦拭檢測圖譜，可以進行快速判別。另外，0.1 mg／m l染料染色前后南五味子無明顯顏色變化，但仍可檢測出SERS信號，因此紙基-SERS可基本滿足快速鑒別染色藥材的需要。

圖3 1μl（0.1 mg／m l）R6G滴于不同保存時間銀膠紙上所得SERS檢測圖譜

圖4 保存10 d銀膠紙的增強效果變化圖

圖5 空白銀膠紙（a）及市售南五味子（b）的SERS檢測圖譜

圖6 0.1mg／m l赤蘚紅（a）和酸性紅（b）染料溶液的標準SERS檢測圖譜

圖7 銀膠紙檢測被不同濃度赤蘚紅染色的南五味子的擦拭檢測圖譜

圖8 用銀膠紙檢測被不同濃度酸性紅染色的南五味子的擦拭檢測圖譜

4 結(jié)論

筆者采用紙基-SERS法成功鑒別了低濃度酸性紅和赤蘚紅染色的南五味子；先后對銀溶膠的濃縮倍數(shù)、銀膠紙的SERS增強效果及穩(wěn)定性等因素進行系統(tǒng)考察。另外，優(yōu)化銀膠紙的干燥和保存時間以延長其“保質(zhì)期”將成為今后研究的方向之一。筆者相信，隨著研究的不斷深入，所建立的紙基-SERS法將為染色中藥材的鑒別及中藥材質(zhì)量監(jiān)督提供一種新的快速而可靠的分析方法。

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Rapid identification of dye adulteration in Kadsura longipedunculata by paperbased SERS

ZHANG Guoqing1，LIDan2，WANG Kebing1（1.Department of Pharmacy，No.169 Hospital of PLA，Hengyang 421002，China；2.School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo establish a paper-based surface-enhanced Raman scattering（SERS）method for the detection of dyed Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.MethodsSupported silver nanoparticles on filter paper were synthesized simply by soakingmethod.In addition，factors including enrichment ratio of silver nanoparticles，the enhancementeffectand stability of the SERS devicewere investigated.ResultsThe Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep，dyed by Erythrosine or Acid Red at low concentration had been detected successfully.ConclusionCombined w ith the paper device and SERS，the approach was rapid and non-destructivewhich could be used to identification of dyed Kadsura longipedunculata FinetetGagnep.

SERS；Ag NPs-paper；Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.；dyeing adulteration

R917

A

1006-0111（2015）03-0213-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.006

2015-02-13

2015-04-14

［本文編輯］顧文華

科技部重大科學儀器設(shè)備開發(fā)專項（2012YQ180132）

張國慶，本科，副主任藥師.研究方向：醫(yī)院藥學和臨床藥理.Tel：13017175511；E-mail：pla169yyyxk＠163.com