王娜，楊曉洪，郭欣妍，陳彪，葉波平，葛峰

1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042 2. 國家環(huán)境保護農藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，南京 210042 3. 中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009

磺胺類耐藥菌中抗性基因sul的表達規(guī)律

王娜1,2，楊曉洪3，郭欣妍1,2，陳彪3，葉波平3，葛峰1,*

1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042 2. 國家環(huán)境保護農藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，南京 210042 3. 中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009

抗生素環(huán)境污染是影響抗生素抗性基因傳播和擴散的主要因素，然而關于抗生素耐藥菌在抗生素暴露下抗性基因的表達機制研究甚少。本研究利用RT-PCR方法檢測了土壤中優(yōu)勢耐藥菌菌株炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis SYN201, G+)和弗氏志賀菌菌株(Shigella flexneri NJJN802, G-)在含有不同濃度磺胺類藥物的培養(yǎng)基中生長不同時間后抗性基因(sul1、sul2、sul3)的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)：無論培養(yǎng)基中是否存在磺胺類藥物，菌株SYN201和NJJN802中的3種磺胺類抗性基因均分別在培養(yǎng)的第72小時或36小時出現(xiàn)一個明顯的表達峰，而在其他培養(yǎng)時間下不表達或表達量處于相對極低的水平；磺胺嘧啶的存在有助于提高菌株在此特征表達時間下抗性基因的表達水平，與未加磺胺嘧啶組相比，暴露于磺胺嘧啶(60 μg·mL-1)組的sul1、sul2和sul3在菌株SYN201中的相對表達量分別提高了2.5、4.8和3.2倍，而在菌株NJJN802中的相對表達量分別提高了3.7、6.0和5.0倍。通過將耐藥菌暴露于不同磺胺嘧啶濃度下考察sul基因相對表達情況，研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中磺胺嘧啶濃度的升高(0～1 024 μg·mL-1)，菌株SYN201和NJJN802中sul基因的表達量整體上呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。本研究對揭示磺胺耐藥菌的抗性表達規(guī)律及抗生素暴露對其抗性表達發(fā)揮的作用具有重要意義。

磺胺嘧啶；炭疽芽孢桿菌；弗氏志賀菌；sul基因表達；抗性基因

Received 30 April 2015 accepted 5 August 2015

近年來，抗生素在醫(yī)療業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中存在著嚴重的濫用現(xiàn)象，并且抗生素會通過污水處理系統(tǒng)排水或者農田施用方式進入到環(huán)境中[1]。抗生素環(huán)境污染是影響抗生素抗性基因(ARGs)傳播和擴散的主要因素[2]。作為一類具有廣譜抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌活性并且價格低廉的抗菌藥物，磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床、畜牧和水產養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應用。然而，隨著養(yǎng)殖業(yè)中磺胺類藥物的大量使用，研究者們在畜禽體內、排泄物及周邊環(huán)境(土壤、水體)中檢測到了多種磺胺類耐藥微生物。畜禽體內及畜禽排泄物中檢測到的磺胺耐藥菌株多為腸球菌屬(Enterococcus)和大腸桿菌(Escherichia coli)，土壤及水體中多為桿菌[3]。土壤中的耐藥菌包括不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、嗜冷桿菌(Psychrobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、叢毛平胞菌屬(Comamonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、氣球菌屬(Aerococcus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、狹長平胞菌屬(Stenotrophomonas)[3]。

迄今為止，盡管很多的報道都顯示抗菌藥物可誘導微生物產生耐藥性，但對于微生物在怎樣的抗生素誘導濃度下才能產生抗性或者進行抗性基因的表達這一機制并不清楚。理論上推測：耐藥菌的產生可能需要一個合理濃度范圍內的抗菌藥物進行刺激，當抗菌藥物濃度高于這個濃度范圍時，菌體在尚未產生抗性的情況下可能就已被藥物殺死，而當低于這個濃度范圍，抗菌藥物所產生的脅迫壓力可能并不足以導致菌體因不適而尋求改變，故不會產生抗性[4]。因此，探討菌株中與耐藥相關的抗性基因在不同的抗生素選擇壓力下的表達規(guī)律，將有助于加深對這些耐藥菌產生耐藥性的認識，同時，相關數據也能為建立針對抗生素的環(huán)境安全評估和預警體系提供線索。

在本研究中，我們以在施用過畜禽糞肥土壤中篩選出的常見耐藥致病菌炭疽芽孢桿菌菌株(Bacillus anthracis SYN201)和弗氏志賀菌菌株(Shigella flexneri NJJN802)為目標菌株，利用RT-PCR方法探究了它們在含有不同濃度磺胺類藥物的培養(yǎng)基中生長不同時間時，3種抗性基因(sul1、sul2、sul3)的表達變化規(guī)律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

革蘭氏陽性菌(G+)：炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis SYN201)，分離于江蘇省宿遷市沭陽縣養(yǎng)豬場的磺胺耐藥菌。

革蘭氏陰性菌(G-)：弗氏志賀菌(Shigella flexneri NJJN802)，分離于江蘇省宿遷市沭陽縣養(yǎng)豬場的磺胺耐藥菌。

RNA提取試劑盒(RNApro Total RNA Isolation Reagent)購自上海啟動元生物科技有限公司，cDNA逆轉錄試劑盒購自北京全式金生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磺胺類耐藥菌的生長曲線分析

取3 mL在LB液體培養(yǎng)基上活化6 h的測試菌株(SYN201或NJJN802)接種到裝有150 mL LB液體培養(yǎng)基或含60 μg·mL-1磺胺嘧啶LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩混勻后，取2 mL于分光光度計上測定OD600，此為培養(yǎng)0 h的讀數。將接種菌株后的三角瓶置于搖床上，37 ℃下，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔1～2 h取2 mL菌液測定OD600，直至培養(yǎng)后的第96小時。

1.2.2 不同誘導時間對磺胺類耐藥菌中抗性基因表達的影響

將待測菌株培養(yǎng)在含60 μg·mL-1磺胺嘧啶的LB液體培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0、6、12、24、36、48、72、96 h，離心收集菌株后，提取菌株總RNA，逆轉錄成cDNA第一鏈后，進行熒光實時定量RT-PCR分析；其間設置平行對照，即同樣的菌株在不含抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、6、12、24、36、48、72、96 h，分析抗性基因的表達變化。

1.2.3 不同濃度的磺胺嘧啶對磺胺類耐藥菌抗性基因表達的影響

在1.2.2分析結果的基礎上，將菌株Bacillus anthracis SYN201和Shigella flexneri NJJN802分別接種在含有不同濃度(0、2、8、16、32、64和1 024 μg·mL-1)磺胺嘧啶的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃分別培養(yǎng)72 h或36 h，離心收集菌株，提取菌株總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據RNA提取試劑盒說明書提取不同時間及不同濃度下的細菌總RNA，測定總RNA的A260和A280，并結合瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度、純度和質量。

按照逆轉錄試劑盒說明書，利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix逆轉錄試劑盒對提取的不同時間點或不同濃度下的總RNA樣品(4 μg)分別進行逆轉錄，合成cDNA第一鏈作為熒光實時定量RT-PCR分析的模板。

qPCR分析：以16S rDNA基因作為內參基因，sul1、sul2和sul3引物序列見表1。參照Ultra SYBR mixture試劑盒說明書在CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System (Biorad, USA)儀上進行Real-Time PCR，擴增條件為95 ℃熱變性10 min，后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性15 s，60 ℃反應1 min，最后60 ℃升到95 ℃，其間每個0.5 ℃采集一次熒光以生成熔解曲線，根據溶解曲線的變化檢測

表1 qPCR引物設計Table 1 Primers for qPCR

擴增結果的特異性。將目標菌株培養(yǎng)在不含抗生素的液體培養(yǎng)基中，以此條件培養(yǎng)的菌株總RNA作為對照，以方山土樣為陰性對照組，將實驗組的△Ct值減去對照組的△Ct值，結果采取2-△△Ct法進行數據處理，分析抗生素脅迫下的抗性基因表達。

1.2.4 細菌培養(yǎng)基中磺胺嘧啶殘留量測定

利用高效液相色譜法(HPLC)測定上述培養(yǎng)過程中各個時間點培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的殘留量。HPLC分析方法參照Lai和Hou等[5]的方法，所用儀器為Waters2695型HPLC，檢測波長為270 nm。同時，按照10倍倍比稀釋的方法制備磺胺嘧啶標準品，同樣條件下分析以獲取磺胺嘧啶藥物的標準曲線。根據樣品檢測結果，計算培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的殘留量。

1.2.4 數據分析

所有測定的數據以“平均值±方差”表示，組間差異采用Students’t-test方法。P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 磺胺類藥物對耐藥菌生長的影響

通過分析不同采樣時間菌液的OD600值，分析菌株SYN201和NJJN802在含磺胺嘧啶的培養(yǎng)基和不含磺胺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的生長曲線，分析結果如圖1所示。通過HPLC檢測2種菌株在生長過程中培養(yǎng)基內磺胺嘧啶濃度的變化，發(fā)現(xiàn)菌株201和802培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的濃度在培養(yǎng)96 h后分別為培養(yǎng)前的88.5%和96.1%，不同時間的濃度值見表2。由此可知，2株菌的對數生長期均出現(xiàn)在16 h左右，同時60 μg·mL-1磺胺嘧啶的暴露并未對菌株的生長規(guī)律產生顯著影響。

圖1 磺胺類耐藥菌株SYN201 (A)和NJJN802 (B)的生長曲線

2.2 耐藥菌菌株中抗性基因的表達

2.2.1 不同時間2種細菌的抗性基因表達規(guī)律

分別在菌株培養(yǎng)0、6、12、24、36、48、72、96 h后，檢測菌株SYN201和NJJN802在空白LB液體培養(yǎng)基及含有60 μg·mL-1磺胺嘧啶的LB液體培養(yǎng)基中3種抗性基因sul1，sul2和sul3的表達量，結果如圖2所示?？芍?，無論菌株是否暴露于磺胺嘧啶，sul基因的表達均在特定時間發(fā)生，SYN201在72 h時表達，NJJN802在36 h時表達。然而，暴露于磺胺嘧啶卻可以顯著提高該表達時間下的sul基因表達量，菌株SYN201在培養(yǎng)72 h時sul1、sul2和sul3的表達量相較于未加磺胺嘧啶的對照組分別提高了2.5、4.8和3.2倍，菌株NJJN802在培養(yǎng)36 h時sul1、sul2和sul3的表達量相較于未加磺胺嘧啶的對照組分別提高了3.7、6.0和5.0倍。與菌株SYN201的sul基因表達水平(圖2 a～c)不同的是，菌株NJJN802中3種sul基因的相對表達水平在各組中基本一致(圖2 d～f)。

表2 不同時間培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的濃度

Table 2 Concentration of sulfadiazine in the culture medium of the resistant bacteria at different times

時間/hTime/h菌株SYN201培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的濃度/(μg·mL-1)SulfadiazineconcentrationintheculturemediumofstrainSYN201/(μg·mL-1)菌株NJJN802培養(yǎng)基中磺胺嘧啶的濃度/(μg·mL-1)SulfadiazineconcentrationintheculturemediumofstrainNJJN802/(μg·mL-1)052.1952.41651.6549.591250.4249.322450.2151.313651.0448.914851.3553.036041.1449.837250.2651.399646.2050.39

圖2 不同培養(yǎng)時間下菌株SYN201(a～c)和NJJN802(d～f)中sul基因的表達

2.2.2 磺胺嘧啶濃度對耐藥菌菌株中sul基因表達的影響

根據抗性基因在不同時間的表達分析結果，將菌株SYN201和NJJN802分別接種在含有不同濃度磺胺嘧啶的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h(菌株SYN201)和36 h(菌株NJJN802)，提取總RNA，利用RT-PCR方法檢測sul基因在不同濃度時相對于未添加藥物時的表達量，結果如圖3所示。可知，隨著培養(yǎng)基中磺胺嘧啶濃度的升高(0～1 024 μg·mL-1)，菌株SYN201和NJJN802中sul基因的表達量整體上呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢。通過SPSS軟件計算磺胺暴露濃度與sul基因表達量的Pearson’s相關系數(r)，所得結果如表3所示。菌株SYN201的sul 2基因表達與磺胺嘧啶暴露濃度相關性良好，r值為0.890，顯著性強；菌株NJJN802的sul1和sul2基因表達與磺胺嘧啶暴露濃度相關性極強，r值分別為0.991和0.946，顯著性極強。菌株SYN201在磺胺嘧啶暴露濃度為64 μg·mL-1時sul1基因相對無磺胺嘧啶暴露時提高了2 404倍，而在磺胺嘧啶暴露濃度為1 024 μg·mL-1時sul1基因相對無磺胺嘧啶暴露時則提高了1 943倍，并未出現(xiàn)成倍數上升的趨勢，這可能因為不同磺胺耐藥菌的抗性基因表達與磺胺嘧啶暴露濃度呈現(xiàn)出的線性相關都存在一定的有效濃度范圍，超過最高限值的磺胺嘧啶抑制了耐藥菌的正常生長和繁殖，從而使得耐藥菌表達sul1基因的量減少。由結果可知，在同一株菌內，3種磺胺類抗性基因的表達水平呈現(xiàn)sul1>sul2>sul3的趨勢。而sul3基因表達量少，且其表達與暴露濃度的相關性不強。

圖3 磺胺耐藥菌菌株SYN201(A)和NJJN802 (B)中sul基因在不同磺胺嘧啶濃度下的表達

表3 磺胺嘧啶暴露濃度與sul基因表達量的Pearson’s 相關系數Table 3 Pearson correlation coefficients between sulfadiazine concentrations and expression of sul genes

注：*代表顯著性強P<0.05，**代表顯著性極強P<0.01。

Note: * represents statistic significance P<0.05, ** represents statistic significance P<0.01.

3 討論(Discussion)

目前，盡管不少研究顯示磺胺抗生素暴露會誘導微生物產生耐藥性[6-7]，但是有關微生物暴露于何種濃度水平的抗生素中會誘導產生抗性基因或使得抗性基因進行表達一直未有定論。本研究初始設計為將無抗性基因的標準菌暴露于磺胺嘧啶中，探討藥物誘導抗性基因產生的規(guī)律，但是試驗未得到成功的結果。國內外已有不少文獻報道了環(huán)境介質以及耐藥菌中3種磺胺耐藥基因的分布水平[8-10]，但有關3種磺胺類耐藥基因在耐藥菌中的表達特征問題卻未見報道，于是將試驗設計改為培養(yǎng)養(yǎng)殖場采樣得到耐藥菌，觀察耐藥菌的抗性表達規(guī)律以及抗生素暴露對其抗性表達發(fā)揮的作用。

磺胺類抗生素的抗菌機制是由于其化學結構類似于對氨基苯甲酸(PABA)，從而可以與PABA競爭二氫葉酸合成酶，阻斷細菌中二氫葉酸的生物合成，并進而抑制以二氫葉酸為底物的四氫葉酸的生物合成過程，影響核酸前體物嘌呤和嘧啶的合成，由此抑制細菌的正常生長和繁殖[11]?；前房股啬退帣C制主要與DHPS的突變基因sul 1-3相關[11-13]，其調控表達的二氫葉酸合成酶與磺胺類的結合能力相較于野生型降低了10 000倍左右[14,15]。然而，本研究結果顯示當培養(yǎng)基中的磺胺嘧啶濃度為60 μg·mL-1時，菌株的生長規(guī)律并未受到影響，即在2株菌的對數生長期并不是sul基因表達的時間。這可能是因為LB液體培養(yǎng)基的主要成分之一——酵母提取物富含蛋白質、肽、核苷酸、氨基酸以及維生素等成分，可以滿足細菌正常生長和繁殖的需要。在對數生長期內，菌株生長環(huán)境中存有大量的PABA或者二氫葉酸合成酶，磺胺嘧啶暴露濃度60 μg·mL-1尚不足以完全阻斷菌株生長環(huán)境中二氫葉酸合成酶對PABA合成四氫葉酸的過程。但是，由于培養(yǎng)基中嘌呤和嘧啶等合成有關成分不斷被消耗，因此磺胺嘧啶對菌株的生長抑制作用于16 h后逐漸開始顯現(xiàn)，這也可能是菌株在特定時間表達sul基因的原因。

試驗發(fā)現(xiàn)3種sul基因在微生物體內的表達具有時間特異性，其中可能存在著一種嚴謹的表達調控模式。無論有無磺胺抗生素的暴露，菌株SYN201和NJJN802中磺胺類抗性基因(sul1、sul2、sul3)分別在第72小時或36小時表達最高。但是，3種sul基因在該特定時間上表達后又迅速下降至一個極低的水平，其中具體機制在本實驗中尚無法給出明確的解釋，這同時是值得進一步研究的內容。

試驗發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內，隨著磺胺嘧啶暴露濃度的增加，sul基因的表達隨之顯現(xiàn)出上升趨勢，且大多數sul基因呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。當磺胺抗生素暴露濃度超過最高限值，耐藥菌的正常生長和繁殖即受到抑制，從而使得耐藥菌表達sul基因的量減少。在同一株菌內，3種磺胺類抗性基因的表達水平呈現(xiàn)sul1>sul2>sul3的趨勢。

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◆

Expression Patterns ofsulGenes in Sulfonamide-Resistant Bacteria

Wang Na1,2, Yang Xiaohong3, Guo Xinyan1,2, Chen Biao3, Ye Boping3, Ge Feng1,*

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, MEP, Nanjing 210042, China 2. Key Laboratory of Pesticide Environmental Assessment and Pollution Control, MEP, Nanjing 210042, China 3. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

Antibiotic pollution is the key factor for the transport and spread of antibiotic resistance genes (ARGs). However, there were few reports on the expression mechanism of ARGs in antibiotic resistant bacteria (ARBs) under the exposure of antibiotics. The different expression of sul genes were detected by RT-PCR respectively in Bacillus anthracis (SYN201, G+) and Shigella flexneri (NJJN802, G-) at different times and different sulfadiazine concentrations. It is found that the mRNA levels of sul genes in strain SYN201 and NJJN802 reached climax at 72 h and 36 h respectively regardless of exposure to sulfadiazine, whereas they did not express, or express at a relatively low level at other times. The presence of sulfadiazine was helpful to improve the expression level of resistance gene at 72 h for SYN201 and 36 h for NJJN802. Compared with the group without sulfadiazine, the relative expression of sul1, sul2 and sul3 in strain SYN201 exposed to 60 μg·mL-1sulfadiazine increased as 2.5, 4.8 and 3.2 times, and that in NJJN802 increased as 3.7, 6.0 and 5.0 times. When investigating the relative expression level of sul genes in the resistant strains under the exposure to different concentrations of sulfonamides, we found that the expression levels of sul genes in the resistant strains SYN201 and NJJN802 increased as the exposure concentrations of sulfonamides (0-1 024 μg·mL-1) increased. This study will shed light on the expression characteristics of ARGs of sulfadiazine-resistant bacteria and the role of antibiotic exposure in the expression of ARGs.

sulfadiazine; Bacillus anthracis; Shigella flexneri; Sul gene expression; antibiotic resistance genes

國家自然科學基金(No. 21507037)；環(huán)保公益專項(201309031，201109038)

王娜(1983—)，女，博士，助理研究員，研究方向為有機污染物的生態(tài)與健康風險，E-mail: wangna@nies.org；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: gefeng@nies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20150430001

2015-04-30錄用日期：2015-08-05

1673-5897(2015)5-075-08

X171.5

A

葛峰(1981—)，男，環(huán)境微生物學博士，副研究員，主要研究方向環(huán)境毒理學，發(fā)表學術論文40余篇。

王娜，楊曉洪，郭欣妍, 等. 磺胺類耐藥菌中抗性基因sul的表達規(guī)律[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(5): 75-81

Wang N, Yang X H, Guo X Y, et al. Expression patterns of sul genes in sulfonamide-resistant bacteria [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 75-81 (in Chinese)