張瀅楹，耿金菊，任洪強(qiáng)，許柯，丁麗麗

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京210023

環(huán)境濃度抗生素選擇性壓力改變活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)

張瀅楹，耿金菊*，任洪強(qiáng)，許柯，丁麗麗

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京210023

四環(huán)素；磺胺甲噁唑；活性污泥；微生物群落結(jié)構(gòu)；廢水處理效能

近年來，隨著抗生素的大量使用，由此產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境影響也越發(fā)受到人們的關(guān)注。全球抗生素的年消耗量約在10～20萬t，85%以上的抗生素或其代謝產(chǎn)物經(jīng)由病人和動物的糞尿排出體外，從而進(jìn)入到生態(tài)環(huán)境[1-2]。進(jìn)入環(huán)境中的抗生素除了會對土壤和表層水體等造成化學(xué)污染外，還可能誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥細(xì)菌和抗性基因，且抗性基因在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播、擴(kuò)散并持久性殘留，抗性基因往往可能比抗生素本身的危害更大[3]。目前，城市生活污水、醫(yī)院污水、地表水甚至部分地下水都已檢出多種抗生素的存在，濃度在ng·L-1～ mg·L-1量級。四環(huán)素(TC)和磺胺甲噁唑(SMX)作為常用的廣譜類抗生素，被廣泛地用于治療細(xì)菌感染引起的疾病，在環(huán)境中檢出頻率較高。污水處理廠二級出水中檢出濃度可達(dá)到0.5～10 μg·L-1[4-6]，部分制藥廢水中濃度則高達(dá)mg·L-1量級[7]。

環(huán)境中抗生素濃度和種類的不斷增加可能會改變微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。據(jù)研究報道，河流中抗生素的存在會改變生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)，并隨著抗生素污染程度的加重，生物膜中對應(yīng)的放線菌含量也隨之升高[8]。在硝化生物膜反應(yīng)器中，四環(huán)素的存在導(dǎo)致了部分菌屬如Flavobacterium、Caulobacter 、Zooglea 等含量的降低，但同時伴隨著Sandarakinorhabdus 等菌種含量的增加[9]。在瀝濾池污水處理系統(tǒng)中，四環(huán)素的存在會減少其中微生物種類和數(shù)量，優(yōu)勢種群的減少幅度最高可達(dá)15%[10]。污水處理系統(tǒng)作為抗生素進(jìn)入天然水環(huán)境的主要途徑，是水環(huán)境中抗生素的重要貯存地和傳播源，活性污泥法是污水處理的主要工藝，然而迄今為止，抗生素選擇性壓力對活性污泥法中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能影響的研究尚少且不夠深入。

本研究分別以TC和SMX兩種抗生素作為研究對象，探討了環(huán)境濃度(5 μg·L-1和50 μg·L-1)抗生素選擇性壓力下，生物處理過程污水處理效能及活性污泥微生物活性的變化，并利用磷脂脂肪酸(PLFA)及16S rRNA基因高通量測序研究了其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為科學(xué)評價抗生素類污染物在污水生物處理工藝中的環(huán)境風(fēng)險提供理論依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 試劑與材料

實驗中所用的TC及SMX均購自北京百靈威科技有限公司，純度≥98%。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純，購自南京化學(xué)試劑有限公司。

實驗所用的接種污泥來源于南京江心洲污水處理廠(A/O工藝)的曝氣池，污泥濃度約為4 500 mg·L-1，VSS/SS(揮發(fā)性固體懸浮物與總固體懸浮物之比)約為0.7 ～ 0.8，污泥沉降指數(shù)SVI在80 ～120之間。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應(yīng)器的啟動與運(yùn)行

將取自污水處理廠的活性污泥分別接種到6個相同的序批式活性污泥反應(yīng)器(SBR)中，SBR反應(yīng)器分為進(jìn)水、反應(yīng)、沉淀、出水和閑置5個基本過程，其操作靈活性好，可以很好地模擬以A/O為主體的市政污水處理工藝。實驗中反應(yīng)器有效體積為4 L，其中R0為無抗生素添加的對照組，R1添加50 μg·L-1TC，R2添加50 μg·L-1SMX，R3添加5 μg·L-1TC，R4添加5 μg·L-1SMX，R5添加5 μg·L-1TC和5 μg·L-1SMX。實驗配制的模擬廢水由C6H12O6、NH4Cl和KH2PO4及微量元素組成，進(jìn)水COD為300 mg·L-1，其中C:N:P為100:5:1(質(zhì)量比)。6個反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)保持一致，污泥濃度控制在3 000 mg·L-1，單個運(yùn)行周期為12 h(包括進(jìn)水0.5 h，曝氣10 h，沉淀1 h，出水0.5 h)，污泥停留時間7 d，進(jìn)水pH為6.8～7.0，溶解氧控制在(3.75±0.30) mg·L-1，溫度維持在(25±5) ℃。

1.2.2 檢測指標(biāo)與方法

PLFA為甲基化活性污泥中提取的磷脂后得到的脂肪酸產(chǎn)物，不同微生物能夠通過不同生化反應(yīng)形成不同的磷脂脂肪酸，從而使其具有特異的指示性。PLFA的提取方法根據(jù)Balser等的方法進(jìn)行了適當(dāng)修正[14-15]，通過對活性污泥樣品的提取、分離及皂化、甲基化、萃取等一系列前處理，最終將提取出的PLFA采用安捷倫7800A氣相色譜進(jìn)行測定。氣相色譜各參數(shù)由MIDI Sherlock程序設(shè)置調(diào)用[16-17]。

微生物群落結(jié)構(gòu)(主要為細(xì)菌)采用16S rRNA基因高通量測序(Miseq, Illumina)進(jìn)行檢測。污泥樣品4 000 r·min-1后棄上清液，利用FastDNA?SPIN Kit for Soil (Qbiogene, USA)進(jìn)行DNA的提取，提取后的DNA樣品利用基于細(xì)菌16S rRNA gene V1V2區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括5 μL的10×Ex Taq Buffer，4 μL的MgCl2(25 μmol·L-1)，0.25 μL的Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)，1 μL正反引物(20 μmol·L-1)，2 μL的DNA模板(20 ng·μL-1)，加滅菌水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：初始變性98 ℃、5 min；98 ℃變性30 s，退火50 ℃、30 s，72 ℃延伸40 s，20個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后，采用純化試劑盒(Cycle-Pure Kit, OMEGA Bio-tek, Inc.) 純化后送至江蘇中宜金大分析檢測有限公司進(jìn)行Miseq測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

PLFA和16S rRNA基因高通量測序解析微生物群落結(jié)構(gòu)均選取了R0為代表作為生物平行樣品，測定結(jié)果平行性良好，證明以上2種方法具有可行性。

常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理采用Origin 9.0軟件，微生物活菌比結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行分析，Miseq數(shù)據(jù)經(jīng)Sickle及Mothur降噪后，通過RDP分類處理。單因素方差分析AVONA用于檢驗不同樣品對于各項微生物活性指標(biāo)是否具有顯著性差異，當(dāng)P< 0.05時，認(rèn)為具有顯著性差異，使用的分析軟件為SPSS statistics 22.0.0。

香農(nóng)-威爾(Shannon-Wiener)多樣性指數(shù)通常被定義為：

式中，H 為Shannon-Wiener指數(shù)，s 是每個樣品中磷脂脂肪酸的總數(shù)，pi為各磷脂脂肪酸占總峰面積的的百分比。氣相色譜分析的峰面積用來計算為每個磷脂脂肪酸的pi值[17]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 抗生素選擇性壓力對廢水處理效能及微生物活性的影響

不同抗生素選擇性壓力下SBR反應(yīng)器在整個運(yùn)行階段的COD去除率如圖1所示。由圖可見反應(yīng)器在30 d左右達(dá)到穩(wěn)定運(yùn)行態(tài)，在相應(yīng)的操作條件下，COD的去除率均高于90%，不同反應(yīng)器穩(wěn)定后的COD平均去除率為R0(93.2%)，R1(91.87%)，R2(90.26%)，R3(92.64%)，R4(91.68%)，R5(91.41%)。2種濃度的TC和SMX持續(xù)添加條件下， 6個反應(yīng)器COD去除率無顯著性差異(P> 0.05)，相比之下，添加了TC的實驗組(R1，R3)對COD去除效果略好于SMX組(R2，R4)。

圖2給出了6個SBR反應(yīng)器在運(yùn)行階段NH4+-N的去除效果，由于硝化菌的世代周期較長，因此前30 d中NH4+-N的去除效果不穩(wěn)定，超過30 d后，各反應(yīng)器的脫氮過程逐漸進(jìn)入穩(wěn)態(tài)，平均NH4+-N去除率分別為R0(78.57%)，R1(74.93%)，R2(73.94%)，R3(76.98%)，R4(75.36%)，R5(76.11%)。同COD的去除效果類似，6個反應(yīng)器之間NH4+-N的去除效果也無顯著性差異(P> 0.05)。

各反應(yīng)器進(jìn)出水抗生素濃度測定結(jié)果如表1所示。TC和SMX在SBR反應(yīng)器中去除率維持在25%～30%間，這與反應(yīng)器各操作運(yùn)行參數(shù)(污泥齡、水力停留時間)等因素有關(guān)。

采用LIVE/DEAD熒光染色法作為微生物活菌水平的檢測方法，可以從微生物細(xì)胞膜完整性的角度評價污泥系統(tǒng)中微生物的活菌水平，具有前處理簡單、測定方便、不受細(xì)菌種類影響等諸多優(yōu)點。微生物活菌比可以用來判定活性污泥在受到抗生素選擇性壓力下細(xì)胞膜的損傷程度(表2)。反應(yīng)器進(jìn)入穩(wěn)定階段后，暴露于抗生素選擇性壓力下的活性污泥活菌比相比于空白組有所上升，最高為添加了50 μg·L-1SMX的實驗組R2，其活菌比例占65.67%，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析各組間并無顯著性差異(P> 0.05)。

在微生物代謝過程中，三磷酸腺苷(ATP)對提供生命活動所需的能量有著極為重要的作用?；钚晕勰囿w系中可以用ATP含量來直觀反映微生物的代謝水平，分析簡單快速。由表2可知，添加了抗生素的活性污泥微生物ATP含量則顯著下降(P =0.013<0.05)，其中添加50 μg·L-1TC的R1實驗組ATP含量降至(4.55±0.028) RLU/mg MLVSS(以單位混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度MLVSS計量)，低于添加相同濃度SMX的R2實驗組的(8.37±1.05) RLU/mg MLVSS。這表明抗生素選擇性壓力會降低微生物的活性，且TC對微生物活性的影響要大于SMX。

圖2 抗生素選擇性壓力對SBR反應(yīng)器去除的影響removal of SBR reactors

圖3 第60天各反應(yīng)器PLFA生物標(biāo)記優(yōu)勢菌種

圖4 不同抗生素選擇性壓力下SBR反應(yīng)器活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的演變(第60天)

圖5 不同抗生素選擇性壓力下各反應(yīng)器活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)熱圖(屬水平，相對豐度>0.10%，第60天)

2.2 PLFA解析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行末期整個PLFA組成情況如表3所示，PLFA的碳鏈長度主要分布在C12至C20之間。微生物的群落結(jié)構(gòu)即不同類群微生物的相對豐度，可以通過微生物各種群的特征脂肪酸的相對含量表征。PLFA生物標(biāo)記可反映革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及原生動物等的相對含量。一般來說，多種支鏈脂肪酸可以表征革蘭氏陽性菌(如iso-、anteiso-、支鏈脂肪酸)，單不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸可指示革蘭氏陰性菌，特定的脂肪酸(20:2ω6、20:3ω6、20:4ω6)可表征原生動物[17,20]。

如圖3所示，在6個反應(yīng)器中，革蘭氏陽性菌的比例均高于革蘭氏陰性菌，隨著抗生素選擇性壓力的施加，革蘭氏陽性菌明顯高于空白對照組，添加50 μg·L-1TC的實驗組R1革蘭氏陽性菌含量最高，為52.17%，其次是添加50 μg·L-1SMX的實驗組R2(45.65%)，抗生素濃度為5 μg·L-1的R3(40.35%)和R4(40.61%)中革蘭氏陽性菌含量接近，復(fù)合污染的實驗組R5(36.97%)革蘭氏陽性菌比例僅略高于空白對照組R0(34.9%)。革蘭氏陰性菌數(shù)量變化趨勢與陽性菌相反，抗生素選擇性壓力下革蘭氏陰性菌含量均明顯低于空白對照組。另外，添加了抗生素后原生動物的含量也明顯減少，由R0組的3.82%降至R1(0.99%)、R2(0.75%)、R3(0.98%)、R4(1.56%)和R5(2.23%)。為了考察PLFA的豐富度和均勻度，采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)來反應(yīng)微生物種群的多樣性。如表4所示，在低濃度的抗生素選擇性壓力下，穩(wěn)定階段的微生物的群落多樣性指數(shù)相比空白對照組呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3 16S rRNA基因高通量測序解析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

通過16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖4所示，空白對照組的活性污泥主要以變形菌門為主(Proteobacteria , 41.95%)，其中Beta 變形菌(Betaproteobacteria, 30.72%)和Gamma 變形菌(Gammaproteobacteria, 8.96%)是優(yōu)勢菌，而Alpah 變形菌(Alphaproteobacteria, 2.27%)，Delta 變形菌(Deltaproteobacteria , 1.48%)及Epsilion 變形菌(Epsilonproteobacteria , <0.01%)均占比較少。除變形菌門占主體外，其次是放線菌門(Actinobacteria , 32.01%)和擬桿菌門(Bacteroidetes , 9.22%)。另外，含量低于10%的門類微生物包括TM7(7.86%)，厚壁菌門(Firmicutes , 1.13%)，酸桿菌門(Acidobacteria, 1.07%)，硝化螺菌(Nitrospira , 0.96%)等共計11個門。相比之下，暴露于抗生素選擇性壓力的實驗組變形菌門減少明顯，加入50 μg·L-1TC的R1變形菌門減少至33.01%，加入50 μg·L-1SMX的R2影響更為明顯，變形菌門含量驟降至16.53%。暴露于5 μg·L-1TC、5 μg·L-1SMX及兩者同時存在的條件下，變形菌門占比分別為20.58%、24.64%和23.89%?？股剡x擇性壓力下的優(yōu)勢菌是放線菌門，其相對含量分別為R1(45.53%)、R2(51.62%)、R3(57.52%)、R4(47.38%)、R5(55.75%)，而空白對照組R0放線菌門僅為32.01%。除放線菌門外，變化比較明顯的是擬桿菌門，空白對照組R0擬桿菌占比9.72%，而加入TC的實驗組R1和R3擬桿菌門比例減少，分別占5.09%和9.56%，加入SMX的實驗組R2和R4擬桿菌有所上升，分別為17.61%和21.54%，兩者各添加5 μg·L-1的R5中擬桿菌占5.49%，與單獨TC影響的結(jié)果接近。

表1 各反應(yīng)器進(jìn)出水抗生素濃度Table 1 The influent and effluent TC and SMX concentrations of six reactors

表2 各反應(yīng)器活性污泥活菌比及三磷酸腺苷(ATP)含量Table 2 Live/dead values and adenosine triphosphate (ATP) concentrations of six SBR reactors

注：MLVSS為混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度。

Note: MLVSS is mixed liquor volatile suspended solids.

表3 第60天各反應(yīng)器中活性污泥整體PLFA情況(%)Table 1 The whole PLFA profiles of activated sludge in six reactors at the 60thday (%)

注：表中數(shù)值代表每個樣品的每個組分的峰值面積占總面積的比值；ND表示未檢出。

Note: The values were the percentage of the peak area of each analyte to the total area of each sample. ND mean not detected.

表4 各反應(yīng)器香農(nóng)-威爾多樣性指數(shù)(第60天采樣)Table 4 Shannon-Wiener diversity indices of PLFA in each reactor (Sampling at the 60thday)

如圖5所示，在屬水平上，空白對照組R0的優(yōu)勢微生物(相對豐度>0.10%)包括Micropruina (18.77%，放線菌門)、Zoogloea (12.28%，變形菌門)、TM7 (7.86%，TM7門)、Dechloromonas (6.26%，變形菌門)、Nakamurella (6.25%，放線菌門)、Rudaea (3.55%，變形菌門)、Terrimonas (1.82%，變形菌門)。添加抗生素的實驗組Micropruina 比例均明顯增加(R129.40%，R224.27%，R324.42%，R430.35%，R532.49%)，Zoogloea 比例明顯減少(R13.73%，R22.99%，R32.7%，R42.24%，R54.73%)，TC和SMX選擇性壓力下該兩種屬變化趨勢較為一致。

3 討論(Discussion)

在對出水水質(zhì)影響方面，低濃度的抗生素選擇性壓力下污水處理效能所受影響不大，COD和NH4+-N的去除效果僅略低于空白對照組(圖1)，這主要是由于本研究中所選擇的抗生素濃度均較低，相當(dāng)或略高于目前實際水體中的檢出水平?？股氐钠骄コ示S持在25%～30%間，與本研究各項工藝操作參數(shù)(如泥齡、水力停留時間等)相關(guān)。

在對微生物活性影響方面，較低的抗生素濃度對微生物的活菌比的影響不具有顯著性差異，說明低濃度的抗生素對微生物的毒性不大，但當(dāng)抗生素的濃度較高、污染較為嚴(yán)重時，死菌的比例會明顯增高。如Proia等[8]研究發(fā)現(xiàn)在多種抗生素選擇性壓力下，生物膜中死菌比例隨著抗生素污染程度的加劇而明顯上升。在低濃度的抗生素選擇性壓力下，ATP含量顯著下降(表2)，ATP含量下降可以表征微生物的活性降低。在微生物代謝過程中，ATP對提供生命活動所需的能量有著極為重要的作用?；钚晕勰囿w系中可以用ATP含量來直觀反映微生物的代謝水平，有研究報道，在低溫等極端條件下，生物膜內(nèi)部ATP含量降低，生物活性降低[18]。尹軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值過大地偏離適宜數(shù)值，或受到S2-、CN-等有毒物質(zhì)影響時，活性污泥微生物細(xì)胞新陳代謝的功能隨之變化，ATP值下降，微生物活性受到不良影響。

在對微生物群落結(jié)構(gòu)影響方面，PLFA鑒定技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用與土壤、水體沉積物、地下水等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中[17]。在低濃度的抗生素選擇性壓力下，通過PLFA生物標(biāo)記法可以看出微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)的降低代表著微生物多樣性的減少。牛川等[21]通過PLFA分析低溫下活性污泥微生物性能時發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下，微生物物種豐富度和多樣性降低。

利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對微生物的種群結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析，可以更深入地了解微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[22]。在低濃度抗生素選擇性壓力下，作為活性污泥微生物優(yōu)勢菌的變形菌門數(shù)量明顯減少，可能是其受抗生素沖擊的影響較大[23]。放線菌明顯增多，在并未發(fā)生絲狀菌膨脹的情況下出現(xiàn)這樣明顯變化，可能是微生物自身在面對抗生素的沖擊下分泌更多的胞外聚合物以形成一層保護(hù)屏障，作為革蘭氏陽性菌，放線菌的增加也驗證了PLFA結(jié)果中革蘭氏陽性菌比例增加。在屬級別上，檢出比例最高的Micropruina 屬于放線菌門，有文獻(xiàn)報道其具有一定的耐毒性[24-25]，在抗生素選擇性壓力下，該屬比例的增加可以證明其具有抵御部分抗生素沖擊負(fù)荷的作用。同時，指示Micropruina 的主要脂肪酸為C14:0 iso、C15:0 anteiso、C16:0、C16:0 iso[26]，這4種脂肪酸在PLFA的結(jié)果中均占主要成分，并通過兩種表征微生物群落結(jié)構(gòu)的手段得到了很好的印證。另外，如圖5所示，Zoogloea 也是重要的微生物之一，屬于Beta 變形菌，該菌是菌膠團(tuán)的主要組成成分[27]，在添加了抗生素后其含量下降，說明抗生素選擇性壓力對于活性污泥微生物菌膠團(tuán)的形成有顯著的影響，這也可以解釋在抗生素存在下ATP含量降低，微生物活性降低的原因。另外，Thiobacter 屬于Gamma 變形菌門，有研究報道該菌屬的存在有利于降解磺胺類有機(jī)物[28-29]，本研究中僅在添加了SMX的反應(yīng)器中檢測到該菌屬，推測其可能會對SMX的降解起到重要作用。

綜上表明：在環(huán)境濃度(5 μg·L-1和50 μg·L-1)TC和SMX兩種抗生素選擇性壓力下，SBR反應(yīng)器中的出水水質(zhì)(COD和NH4+-N)受到的影響不明顯；ATP測定結(jié)果表明活性污泥微生物活性降低；PLFA和16S rRNA基因高通量測序結(jié)果表明微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，革蘭氏陽性菌比例上升，其中主要是放線菌含量增加，革蘭氏陰性菌比例下降，原生動物數(shù)量減少，生物多樣性減少。然而，本研究主要針對60 d抗生素選擇性壓力下活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，長期作用下對污水處理效能的影響及抗生素選擇性壓力對活性污泥體系中抗生素抗性基因傳播的影響還需要進(jìn)一步研究。

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Environmental Concentration Antibiotic Selection Pressure Changed Microbial Community Composition of Activated Sludge

Zhang Yingying, Geng Jinju*, Ren Hongqiang, Xu Ke, Ding Lili

School of the Environment, Nanjing University, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Nanjing 210023, China

Received 24 May 2015 accepted 10 July 2015

tetracycline; sulfamethoxazole; activated sludge; microbial community composition; wastewater treatment efficiency

國家自然科學(xué)基金(No.51278241)

張瀅楹(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為污水深度處理，E-mail: zyyorwheat@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jjgeng@nju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150524001

2015-05-24錄用日期：2015-07-10

1673-5897(2015)5-066-09

X171.5

A

耿金菊(1978—)，女，環(huán)境科學(xué)博士，副教授，主要研究方向水處理與水環(huán)境修復(fù)，廢水深度處理及生物處理，污染物的環(huán)境行為及生態(tài)效應(yīng)。

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