張 琳 贠婷婷 綦文濤* 李 杰 王永偉 李愛(ài)科

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030;2.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

益生菌在疾病防治和抗生素替代方面已經(jīng)表現(xiàn)出了巨大潛力［1］，國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)界認(rèn)可益生菌(probiotics)是一類定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效，從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱［2］。因此，對(duì)于一個(gè)益生菌產(chǎn)品，保存及使用期間保持較強(qiáng)的活力，是其品質(zhì)最關(guān)鍵的評(píng)價(jià)準(zhǔn)則。然而，許多益生菌產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的活菌很少，完全達(dá)不到我國(guó)益生菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定中對(duì)活菌數(shù)的要求［3］。此外，益生菌在加工過(guò)程中，受高溫、高濕及擠壓剪切等外界脅迫作用，其活性又會(huì)大打折扣［4］。體內(nèi)定植過(guò)程中，受胃液、膽汁等內(nèi)部脅迫作用影響，活性會(huì)進(jìn)一步損失［5］。因此，如何提高益生菌的抗脅迫能力，保持其活性，從而提高益生菌的益生作用，一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。而微膠囊技術(shù)被視為解決這一問(wèn)題的有效途徑［6-7］。

微膠囊化技術(shù)在保護(hù)生物活性分子、組織和細(xì)胞以對(duì)抗不利環(huán)境方面已取得了較好的成效［8-10］。其中適合益生菌工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的微膠囊技術(shù)主要有:擠出技術(shù)、乳化技術(shù)、流化床包覆/空氣懸浮技術(shù)、真空冷凍干燥技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)等［2］。其中乳化技術(shù)由于具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易、制備條件較溫和，很適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，也備受益生菌微囊化研究者的關(guān)注［2，11］。但該技術(shù)也存在乳化過(guò)程和制備材料影響益生菌本身生理活性的問(wèn)題［11］。

益生菌產(chǎn)品種類繁多，如何評(píng)價(jià)益生菌產(chǎn)品的品質(zhì)是控制產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。其中益生菌產(chǎn)品對(duì)儲(chǔ)藏、高溫、胃酸和膽汁等體內(nèi)、外脅迫的耐受力是評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)［12］。目前，關(guān)于微囊化益生菌的研究多集中在材料的選擇和工藝的優(yōu)化上，而關(guān)于微囊化益生菌產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的報(bào)道還較少?；诖?，本文采用乳化凝膠化法原理，對(duì)益生菌的代表性菌株——酵母菌和乳酸菌進(jìn)行了微囊化包被，并以未包被的菌粉為對(duì)照，研究了微囊化益生菌對(duì)常見(jiàn)體內(nèi)、外脅迫的耐受情況，以期為推廣使用基于乳化法基礎(chǔ)上的益生菌微囊化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

2株試驗(yàn)菌株分別是布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)和糞腸球菌(Enterococcus faecium)，均為國(guó)家糧食局科學(xué)研究院保藏菌株，布拉迪酵母菌培養(yǎng)條件是:YPD培養(yǎng)基，30℃耗氧培養(yǎng)，14 h;糞腸球菌培養(yǎng)條件是:MRS培養(yǎng)基，37℃耗氧培養(yǎng)，18 h。

1.2 試驗(yàn)材料

海藻酸鈉［化學(xué)純(CP)］、碳酸鈣［分析純(AR)］、冰醋酸(AR)、液體石蠟(CP)、Span80(CP)、無(wú)水氯化鈣(AR)均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)儀器

JJ-4A六聯(lián)電動(dòng)攪拌器，上海喬躍電子有限公司;CKX41生物倒置顯微鏡，日本Olympus公司;Mastersizer 2000激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司;DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;生物安全柜(KS18)、微生物培養(yǎng)箱(BD)，美國(guó)Thermo公司。

1.4 益生菌的微囊化

益生菌細(xì)胞的微囊化方法參照梁新曉等［13］的方法進(jìn)行，向海藻酸鈉溶液中加入碳酸鈣至濃度為10 g/L，混合均勻，滅菌后加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的益生菌種子液，充分混勻作為水相。向液體石蠟中添加體積百分含量為0.1%的Span80作為油相。在400～500 r/m in的攪拌速度下，按照水相與油相體積比為1∶3的比例，向油相中緩慢加入水相，攪拌2～5 m in，然后逐滴加入冰醋酸，反應(yīng)10～15 min，向反應(yīng)體系中加入氯化鈣溶液，使微膠囊緩慢沉降，分離微膠囊，用清水清洗1～2次，后將微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，過(guò)濾分離微膠囊，45℃干燥3 h，得到益生菌微膠囊產(chǎn)品，微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌的活菌數(shù)分別為1×109和1×1010CFU/g。對(duì)照組菌粉同樣45℃干燥3 h，得到布拉迪酵母菌與糞腸球菌菌粉活菌數(shù)分別為1×1010和1×1011CFU/g。

1.5 高溫脅迫耐受試驗(yàn)

在恒溫干燥箱中對(duì)益生菌微膠囊產(chǎn)品進(jìn)行高溫耐受性評(píng)價(jià)，以未包被益生菌菌粉作為對(duì)照。分別取1 g益生菌微膠囊和益生菌菌粉在110和130℃下分別處理30、45和60 s。益生菌微膠囊需經(jīng)破囊后通過(guò)梯度稀釋平板傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，布拉迪酵母菌和糞腸球菌分別于YPD和MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.6 模擬胃腸液脅迫耐受試驗(yàn)

模擬胃液的配制:參考［14］，取 9.5%鹽酸16.4 m L，加蒸餾水稀釋，使 pH 達(dá)到 3.0，按照每100 m L 加 1.0 g胃蛋白酶，混勻，0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取益生菌微膠囊和2種益生菌菌粉樣品各1 g，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的裝有9 m L模擬胃液試管中，37℃ 80 r/min分別處理30、90和180 m in。益生菌微膠囊需加入破囊液中和pH再進(jìn)行梯度稀釋，對(duì)益生菌菌粉與益生菌微膠囊進(jìn)行傾注法活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

模擬腸液的配制:參考文獻(xiàn)［14］，取KH2PO46.8 g，加入500 m L蒸餾水溶解，用4 g/L氫氧化鈉溶液調(diào) pH至 6.8，蒸餾水定容至 1 L，加膽鹽3%，按照100 m L加1 g胰蛋白酶，混勻，0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取益生菌微膠囊和2種益生菌菌粉樣品各1 g，轉(zhuǎn)移到裝有9 m L模擬腸液試管中，37℃ 80 r/min分別處理30、90和180 m in。益生菌微膠囊需加入破囊液中和pH再進(jìn)行梯度稀釋，對(duì)益生菌菌粉與益生菌微膠囊進(jìn)行傾注法活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)表示形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式，其中n=3。數(shù)據(jù)處理采用Excel和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，各組間平均值差異性比較采用的是 one-way ANOVA方法，P＜0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 菌粉與微囊化益生菌耐儲(chǔ)存性比較

由表1可見(jiàn)，在常溫條件下，菌粉布拉迪酵母菌和糞腸球菌的存活率隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，儲(chǔ)存第5個(gè)月存活率分別降低至 6.07%和10.96%。儲(chǔ)存第5個(gè)月微囊化布拉迪酵母菌和微囊化糞腸球菌的存活率分別為40.71%和30.42%，比菌粉組分別高出 34.63%和 19.46%(P＜0.05)。

表1 儲(chǔ)存對(duì)菌粉與微囊化益生菌存活率的影響Table 1 Effects of storage on survival rate of bacteria powder and m icroencapsulated bacteria %

2.2 菌粉與微囊化益生菌耐高溫性能比較

由表2可見(jiàn)，布拉迪酵母菌無(wú)論是菌粉還是微囊化劑型，在110和130℃的高溫下均表現(xiàn)出了較高的耐受性。110℃條件下，微囊化的布拉迪酵母菌耐受性雖然有高于菌粉的趨勢(shì)，但差異并不顯著(P＞0.05)。但在更苛刻的130℃高溫下，微囊化的優(yōu)勢(shì)得到了凸顯，在處理45和60 s條件下，微囊化布拉迪酵母菌的存活率仍然分別高達(dá)88.21%和84.70%。糞腸球菌的耐高溫性明顯不如布拉迪酵母菌，尤其在未包被菌粉條件下，其存活率隨著溫度和處理時(shí)間的增加，幾乎完全喪失。但在微囊化條件下，糞腸球菌的存活率得到了改善，130℃、60 s條件下，其存活率仍然可達(dá)34.04%。

表2 高溫對(duì)菌粉與微囊化益生菌存活率的影響Table 2 Effects of high temperature on survival rate of bacteria powder and m icroencapsulated bacteria %

2.3 菌粉與微囊化益生菌胃液耐受力比較

由表3可見(jiàn)，2種益生菌，尤其是布拉迪酵母菌菌粉的胃液耐受能力極低，處理30 m in后布拉迪酵母菌、糞腸球菌菌粉存活率分別降低70.39%和61.17%，處理 180 m in后分別降低 81.90%和72.00%。微囊化后2株菌的胃液耐受力均顯著提高(P＜0.05)，處理30m in后存活率分別只降低了11.21%和 9.37%，處理 180m in 后分別只降低24.14%和 25.27%。

表3 模擬胃液對(duì)菌粉與微囊化益生菌存活率的影響Table 3 Effects of simulated gastric fluid on survival rate of bacteria powder and m icroencapsulated bacteria %

2.4 菌粉與微囊化益生菌腸液耐受力比較

由表4可見(jiàn)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，布拉迪酵母菌和糞腸球菌的存活率均受到一定程度的抑制，且無(wú)包被菌粉的存活率下降幅度大于微囊化益生菌(P＜0.05)。處理時(shí)間達(dá)到180 m in時(shí)，布拉迪酵母和糞腸球菌菌粉的存活率分別降低了59.20%和52.24%，而其微囊化制劑的存活率則分別只降低了 32.31%和31.08%。

表4 模擬腸液對(duì)菌粉與微囊化益生菌存活率的影響Table 4 Effects of simulated intestinal fluid on survival rate of bacteria powder and m icroencapsulated bacteria %

2.5 微囊化益生菌的模擬體內(nèi)釋放情況

由圖5所示，時(shí)間低于50 m in時(shí)，微囊化益生菌的釋放呈現(xiàn)出較快的速度，時(shí)間高于50 m in時(shí)，釋放速度趨于平緩，50 m in時(shí)微囊化布拉迪酵母菌和微囊化糞腸球菌的釋放率分別可達(dá)71.74%和87.47%，溶液中的微膠囊已經(jīng)基本崩解完全。

圖5 微囊化益生菌的模擬消化道內(nèi)釋放曲線Fig.5 Release ofm icroencapsulated bacteria in simulated gastrointestinal conditions

3 討論

3.1 菌粉與微囊化益生菌耐儲(chǔ)存性比較

相對(duì)于低溫儲(chǔ)存來(lái)說(shuō)，常溫儲(chǔ)存成本低，設(shè)備簡(jiǎn)單，更適合于大量益生菌產(chǎn)品和養(yǎng)殖用戶的存放，同時(shí)也大大降低了益生菌的運(yùn)輸成本。然而常溫儲(chǔ)存的問(wèn)題是益生菌活菌數(shù)下降明顯。本文結(jié)果表明，在常溫儲(chǔ)藏條件下，無(wú)論是酵母菌還是乳酸菌，其存活率降低都極為明顯，可達(dá)90%以上，嚴(yán)重影響了益生菌的使用效果。而微囊化后的益生菌存活率隨儲(chǔ)存時(shí)間的降低趨勢(shì)，相對(duì)于游離未包被菌粉明顯放緩。從第2個(gè)月開(kāi)始，微囊化組存活率即顯著高于菌粉組。因此，微囊化后的益生菌表現(xiàn)出明顯的耐儲(chǔ)藏性能。

3.2 菌粉與微囊化益生菌耐高溫性能比較

益生菌經(jīng)常會(huì)被加工成片劑或顆粒，以便于使用。制粒過(guò)程通常要經(jīng)歷70～90℃，甚至更高的溫度環(huán)境［15］。而益生菌尤其是乳酸菌的高溫耐受性非常低，有研究結(jié)果表明，乳酸菌在制粒后所存無(wú)幾，死亡率達(dá)95%以上。即使是耐熱性最好的芽孢桿菌，經(jīng)制粒后存活率最高也只有80%左右［12］。因此，飼用益生菌的耐熱性是其性能的重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本文結(jié)果表明，微囊化后的益生菌具備了較強(qiáng)的耐受短時(shí)高溫的性能，尤其是乳酸菌的高溫耐受能力得到明顯的提高，這與李旭華等［16］的結(jié)果是一致的。

3.3 菌粉與微囊化益生菌胃液耐受力比較

人體及動(dòng)物胃部的pH偏低，對(duì)益生菌具有潛在的滅活作用，致使其難以有足夠的活菌數(shù)量到達(dá)腸道或定植腸道而發(fā)揮作用。耐酸性可以用簡(jiǎn)單的體外試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)［12］，目前對(duì)于菌株耐酸性試驗(yàn)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，考慮消化酶對(duì)益生菌的影響，有學(xué)者使用添加胃蛋白酶制備的模擬胃液進(jìn)行耐酸性評(píng)價(jià)［17］。本研究采用上述方法，對(duì)微囊化的酵母菌和乳酸菌進(jìn)行了胃液耐受評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示經(jīng)乳化凝膠化法包被后益生菌對(duì)胃環(huán)境的耐受力得到了明顯的提高。對(duì)于雙歧桿菌相關(guān)的研究也給出了類似的結(jié)果［18］。同時(shí)結(jié)果也表明，作為乳酸菌的糞腸球菌胃液耐受力要顯著高于布拉迪酵母菌，推測(cè)與乳酸菌具有一定的產(chǎn)酸能力，因此具有較強(qiáng)的低pH耐受力有關(guān)。

3.4 菌粉與微囊化益生菌腸液耐受力比較

腸道的pH溫和，接近中性，但膽鹽以及其他多種酶類，對(duì)益生菌都有潛在的滅活作用，腸道部位的滲透壓對(duì)微生物的生長(zhǎng)也有很大影響［12］。因此益生菌對(duì)膽鹽的抗性是其能夠在腸道內(nèi)存活、生長(zhǎng)并發(fā)揮功效的先決條件之一。腸道中膽汁的含量在0.03%～0.30%之間波動(dòng)，故本研究采用0.30%膽鹽含量的模擬腸液進(jìn)行了益生菌腸液耐受性試驗(yàn)［19］。本研究結(jié)果表明微囊化后的益生菌，其腸液耐受能力提高，益生菌可在小腸部位充分地發(fā)揮益生作用，并順利到達(dá)大腸，從而進(jìn)一步發(fā)揮作用。模擬腸液條件下益生菌相對(duì)于模擬胃液條件下的高存活率，可能與腸液環(huán)境下近乎中性的pH有關(guān)。

3.5 微囊化益生菌的模擬體內(nèi)釋放情況

微囊化益生菌在體內(nèi)的釋放也是決定其品質(zhì)的重要因素。微生物細(xì)胞固定化在微膠囊中不能釋放，其益生作用會(huì)受到影響。釋放時(shí)間過(guò)快，又起不到有效的保護(hù)作用。本研究顯示，微囊化的益生菌呈現(xiàn)出緩慢釋放的特點(diǎn)，區(qū)別于菌粉的瞬間釋放，這對(duì)于益生菌有效抵抗體內(nèi)胃腸環(huán)境的脅迫影響，有效發(fā)揮作用具有明顯的優(yōu)勢(shì)。此外，糞腸球菌和布拉迪酵母菌的釋放過(guò)程未出現(xiàn)顯著性差異數(shù)據(jù)，且表現(xiàn)出近乎相同的趨勢(shì)，推測(cè)與兩者的微囊化工藝和材料一致，從而導(dǎo)致制備的微膠囊物化特性一致有關(guān)。

4 結(jié)論

基于乳化凝膠化原理上的微膠囊技術(shù)可顯著增強(qiáng)布拉迪酵母菌和糞腸球菌對(duì)儲(chǔ)藏、高溫、胃液和腸液等體內(nèi)、外不良環(huán)境的抗性。同時(shí)，表現(xiàn)出了體內(nèi)緩慢釋放的特點(diǎn)。微囊化布拉迪酵母菌和糞腸球菌對(duì)機(jī)體的實(shí)際應(yīng)用效果和益生作用機(jī)理尚需要進(jìn)一步研究。

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