李 可 羅建杰，2 孟 昆 姚 斌 劉國華 鄭愛娟*

(1.中國農業(yè)科學院飼料研究所，農業(yè)部飼料生物技術重點開放實驗室，北京 100081;2.北京科為博生物科技有限公司，北京 100086)

在動物胃腸道寄居著種類繁多的微生物，這些微生物菌群與寄居宿主之間形成了一個相互依賴和相互制約的微生態(tài)系統(tǒng)［1］。這個微生態(tài)系統(tǒng)存在細菌、古生菌、真菌、原蟲、噬菌體等多種微生物及其分泌的代謝產物［2］。這幾個相互作用和影響的集團之間任何一方發(fā)生改變，整個微生態(tài)系統(tǒng)都會隨之做出相應的變化和調整［3］。腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡對動物養(yǎng)分代謝和機體免疫等方面起著重要作用。研究動物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)有益于揭開胃腸道消化代謝體系的作用機理［4－5］。調節(jié)動物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)可以促進動物健康及營養(yǎng)物質利用［6］。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)在自然界分布廣泛，是一種較為常見的革蘭氏陽性菌。屬于芽孢桿菌屬，其具有耐熱、產酶豐富且產酶量高等優(yōu)良性狀。不僅安全而且在其代謝過程中還可以產生許多有益活性物質［7－8］。楊漢博［9］研究表明，向黃雞飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以有效改善其腸道微生態(tài)平衡。屎腸球菌(Enterococcus faecium)是一類得到廣泛應用的兼性厭氧乳酸菌，其在動物腸道中可以分泌有機酸等代謝產物，提高機體抵御有害微生物的能力從而達到益生作用［10－11］。龔琪［12］研究表明，屎腸球菌的添加可以促進腸道菌群有效完成過渡期，并在穩(wěn)定期保持穩(wěn)定。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)別名酪酸菌，屬于厭氧革蘭氏陽性菌，進入動物腸道后不僅可以分泌具有益生作用的代謝產物還可以抵抗胃酸等消化液的作用，作為新一代的益生菌制劑，具有非常廣泛的應用前景［13－14］。馬洪慶等［15］研究表明，飼糧中添加丁酸梭菌可以提高麻羽肉雞的增重率及有效降低了其料重比。本研究在基礎飼糧中分別添加地衣芽孢桿菌、屎腸球菌和丁酸梭菌，采用PCR－變性梯度凝膠電泳(DGGE)和實時熒光定量PCR(qPCR)技術分析肉雞空腸食糜、回腸食糜和盲腸食糜中微生物菌群種類和數量差異，獲取益生菌對腸道中微生物區(qū)系多樣性影響的信息，闡明不同益生菌對動物腸道菌群結構影響的差異性，為益生菌的產業(yè)開發(fā)和應用研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地衣芽孢桿菌、屎腸球菌(微膠囊，純度大于90%)購自北京挑戰(zhàn)生物技術有限公司，丁酸梭菌(液態(tài)，純度大于90%)購自北京科為博生物科技有限公司，愛拔益加(AA)肉雞購自北京華都肉雞育種有限公司。

1.2 試驗設計

飼養(yǎng)試驗選取432只1日齡的肉公雞，稱量初始體重后分別隨機分成4個組，每個組9個重復，每個重復12只雞。組1飼喂基礎飼糧，組2飼喂基礎飼糧+地衣芽孢桿菌(前期4.8×106CFU/g飼糧;后期 4.7×106CFU/g飼糧)，組 3飼喂基礎飼糧+屎腸球菌(前期 1.0×106CFU/g飼糧;后期1.2×106CFU/g飼糧)，組4飼喂基礎飼糧+丁酸梭菌(前 期 1.3×106CFU/g 飼 糧;后 期 1.2×106CFU/g飼糧)。試驗期為6周，分1～3周齡和4～6周齡2個階段飼養(yǎng)，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在中國農業(yè)科學院飼料研究所昌平區(qū)南口中試基地雞舍進行，采用立體籠養(yǎng)方式。自由采食飼糧，自由飲水，按常規(guī)免疫程序免疫。雞舍光照第1～7天為23 h，7 d以后20 h。雞舍溫度第1～3天為33～35℃，從第4天開始逐步降溫，到第28天降到20℃，在飼養(yǎng)后期一直保持20℃。雞舍濕度在第1周保持60%～70%，第2～6周保持50%～60%。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結束后，每個重復中隨機抽取3只雞，稱體重后，靜脈放血處死，剖開腹腔，在無菌條件下分別采集空腸、盲腸、回腸的食糜置于凍存管中，迅速投入液氮后轉至－70℃保存，備用。

1.5 基因組DNA的提取與PCR擴增

1.5.1 基因組DNA 的提取

應用天根生物技術有限公司糞便基因組提取試劑盒(DP328-02)提取腸道食糜基因組DNA，應用OMEGA真菌基因組提取試劑盒(DP307-02)提取PCR校正工程菌株的基因組DNA。

1.5.2 PCR 擴增

為了比較分析在基礎飼糧中添加益生菌后空腸食糜、回腸食糜和盲腸食糜中微生物群落的變化，根據大腸桿菌的基因組［16］設計了引物338-F及543-R用來特異性擴增16S rDNA V3區(qū)基因片段，片段大小193 bp，在338-F引物的5’端帶有1個40 bp GC夾子。在PCR擴增中以純化過的基因組DNA為模板，進行細菌16S rDNA的PCR擴增。

表2 細菌16S rDNA PCR擴增引物Table 2 Primers used in 16S rDNA PCR for bacteria

1.6 DGGE與指紋圖譜分析

按照DcodeTMUniversal Mutation Detection Systerm的操作說明對細菌16S rDNA進行DGGE指紋圖譜分析。變性物質為甲酰胺和尿素，變性梯度為40%～60%。先在80 V恒定電壓下快速電泳1 h，然后在60 V恒定電壓下電泳16 h;電泳結束后，將凝膠用GelRed染色液染色20 min，再用1×TAE漂洗10 min，然后在 Viber凝膠成像掃描系統(tǒng)中獲取膠圖。

1.7 16S rDNA基因序列的克隆和測序

將比較重要的條帶按照從上到下的順序依次切取編號，純化后用引物338-F(不帶GC夾)和543-R進行PCR擴增，將PCR產物與pEASY-T3載體連接，然后將陽性克隆子菌液送至北京睿博新科生物技術有限公司測序。將獲得的測序用BLAST工具進行序列比對，選擇16S rRNA數據庫進行同源性搜索。選擇同源性最高的序列的細菌株系為參考細菌物種。

1.8 細菌 qPCR

為了檢測益生菌對腸道中細菌菌群數量的影響，采用qPCR技術檢測不同腸段食糜中細菌菌群數量。引物為 GB-F(5’－CGGCAACGAGCGCAACCC－3’)和 GB-R(5’－CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC－3’)，內標基因 RFP 引物為RFP-F(5’－CAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGG－3’)和 RFP-R(5’－CTTGGCCATGTAGATGGACTTGAACTCC－3’)，所用引物都經過qPCR溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測。將16S rDNA片段和RFP片段連接到pGEM-T載體上，然后轉化到TransⅠ-T1宿主中，提取重組質粒之后將其進行梯度稀釋，使其濃度為10～107mol/μL，最后利用質粒為模版制作標準曲線。利用IQ5 qPCR儀檢測不同腸段食糜樣品中的細菌菌群數量。

1.9 數據分析

所有數據經Excel 2013初步整理后，采用SPSS 16.0對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)分析，DGGE圖像用Quantity One軟件處理分析。

2 結果分析

2.1 不同益生菌對肉雞不同腸段 PCR-DGGE指紋圖譜條帶數的影響

由表3可知，飼糧中添加3種不同益生菌均影響了42日齡肉雞空腸、回腸及盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE指紋圖譜(圖1～圖3)。通過軟件 Quantity One分析條帶數可知，PCR-DGGE指紋圖譜的條帶數發(fā)生了不同變化。肉雞空腸:對照組、屎腸球菌組、地衣芽孢桿菌組和丁酸梭菌組的條帶數分別為15.33、18.00、16.67和14.00。其中屎腸球菌組條帶數顯著高于對照組(P＜0.05);而地衣芽孢桿菌和丁酸羧菌組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。肉雞回腸:對照組、屎腸球菌組、地衣芽孢桿菌組和丁酸梭菌組的條帶數分別為 18.67、25.33、22.00 和 14.33。其中屎腸球菌組條帶數顯著高于對照組(P＜0.05);地衣芽孢桿菌和丁酸羧菌組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。肉雞盲腸:對照組、屎腸球菌組、地衣芽孢桿菌組和丁酸梭菌組的條帶數分別為32.00、32.00、34.33 和 31.33，變化均不顯著(P＞0.05)。

表3 PCR-DGGE指紋圖譜條帶數Table 3 The number of bands in PCR－DGGE fingerprints

2.2 不同種類益生菌對肉雞不同腸段菌群結構的影響

2.2.1 不同種類益生菌對肉雞空腸菌群結構影響

飼糧中添加3種不同益生菌均顯著影響了42日齡肉雞空腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCRDGGE指紋圖譜(圖1)。由表4可知，從該指紋圖譜中選取了19條特征條帶進行測序，將得到的序列在GenBank中進行了BLAST相似性分析。結果顯示，這些序列與8個乳酸菌具有很高的相似性(L.equi、L.aviaries、L.hayakitensis、L.salivarius、L.ingluviei、L.gasseri ATCC33323、L.saerimneri、L.agilis)。與對照組相比，屎腸球菌組具有1條明顯的獨有的條帶，而在對照組中沒有出現，從測序結果來看與L.ingluviei最為相似，說明屎腸球菌特異的促進了該菌的生長繁殖。與對照組相比，地衣芽孢桿菌組在條帶種類上無顯著差異(P＞0.05)，但 L.agilis和 L.salivarius的生長得到了促進。與對照組相比，丁酸梭菌組中條帶數無顯著差異(P＞0.05)，但有多條條帶的亮度變弱，甚至消失，說明丁酸梭菌抑制了這些菌的生長繁殖(L.ingluviei、L.gasseri ATCC33323、L.saerimneri、L.agilis)，而條帶3(L.aviaries)在丁酸梭菌組中亮度明顯高于對照組，說明丁酸梭菌促進了其生長繁殖。

圖1 肉雞空腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-DGGE指紋圖譜Fig.1 PCR-DGGE fingerprints genes of the V3 region genes of 16S rDNA amplified from bacteria of jejunal chyme of broilers

表4 肉雞空腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE優(yōu)勢條帶測序結果Table 4 Sequencing results of the predominant bands cut from the 16S rDNA V3 region genes PCR-DGGE of bacteria of the jejunal chyme of broilers

2.2.2 不同種類益生菌對肉雞回腸菌群結構的影響

飼糧中添加3種不同益生菌均顯著影響了42日齡肉雞回腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE指紋圖譜(圖2)。由表5可知，從指紋圖譜中選取了16條特征條帶進行DNA測序，并將得到的序列在GenBank中進行了BLAST相似性分析，結果表明這些序列與7個乳酸菌(L.agilis、L.equi、L.versmoldensis、L.satsumensis、L.gasseri ATCC33323、L.salivarius、L.hayakitensis)，3個屎腸球菌(E.faecium、E.thailandicus、E.cecorum)，3 個梭菌(C.bartlettii、C.irregulare、C.hiranonis DSM 13275)以及1個糞腸球菌(C.eutactus)具有很高的相似性。與對照組相比，屎腸球菌組食糜中E.faecium和E.thailandicus明顯增多，說明飼糧中添加的屎腸球菌在回腸食糜中發(fā)生了生長繁殖。與對照組相比，地衣芽孢桿菌組在條帶種類上無顯著差異(P＞0.05)，但C.eutactus和C.irregulare的生長受到了抑制。與對照組相比，丁酸梭菌組中條帶數無顯著差異(P＞0.05)，但 L.satsumensis、L.gasseri ATCC33323、E.cecorum、L.salivarius、C.eutactus、C.irregulare生長受到了抑制，而L.versmoldensis在丁酸梭菌組中條帶亮度明顯高于對照組，說明丁酸梭菌促進了該菌的生長和繁殖。

2.2.3 不同種類益生菌對肉雞盲腸菌群結構的影響

圖3是不同組42日齡肉雞盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-DGGE指紋圖譜。由表6可知，從該指紋圖譜中選取了43條特征條帶，對其進行了DNA測序，將得到的序列在GenBank中進行了BLAST相似性分析，結果表明盲腸的菌群種類非常的豐富，主要有糞腸球菌、瘤胃球菌、梭菌、擬桿菌、乳酸菌等。從整體上來看，在盲腸中的菌群種類更加豐富多樣，表明在本試驗條件下，肉雞個體之間盲腸菌群結構差異較大。

圖2 肉雞回腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-DGGE指紋圖譜Fig.2 PCR-DGGE fingerprints of the V3 region genes of 16S rDNA amplified from bacteria of ileal chyme of broilers

2.3 不同益生菌對肉雞不同腸段菌群數量的影響

由圖4可知，飼糧添加地衣芽孢桿菌和屎腸球菌顯著提高肉雞空腸食糜中細菌的菌群數量(P＜0.05)，而添加丁酸梭菌對肉雞空腸細菌的菌群數量無顯著影響(P＞0.05)。從回腸食糜的影響來看，添加地衣芽孢桿菌對細菌的菌群數量無顯著影響(P＞0.05)，而飼糧添加屎腸球菌和丁酸梭菌顯著增加了細菌的菌群數量(P＜0.05)。飼糧添加地衣芽孢桿菌顯著增加了盲腸食糜中細菌的菌群數量(P＜0.05)，而添加屎腸球菌和丁酸梭菌顯著降低了盲腸食糜中細菌的菌群數量(P＜0.05)。

3 討論

3.1 不同種類益生菌對肉雞不同腸段菌群結構的影響

腸道微生物是動物機體進行生命活動的一個重要組成單元，隨著動物機體的生長、發(fā)育、疾病和衰老時刻發(fā)生著動態(tài)的變化，它對動物機體的影響是自始至終的［17］。胃腸道微生物的菌群組成與動物的基因組、營養(yǎng)和生活環(huán)境息息相關，它們積極參與宿主物質代謝的調控、信號傳導、免疫防御，研究表明其對宿主的胃腸道、肝臟和腦具有重要的影響［18－20］。同時，胃腸道微生物菌群的密度和數量也影響著機體對營養(yǎng)物質的消化吸收能力以及抵抗疾病的能力［21］。本試驗中，在飼糧中添加3種不同益生菌，肉雞空腸、回腸和盲腸食糜PCR-DGGE指紋圖譜的條帶數及條帶明亮程度發(fā)生了改變，且3種益生菌的作用效果不同。

表5 肉雞回腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE優(yōu)勢條帶測序結果Table 5 Sequencing results of the predominant bands cut from the 16S rDNA V3 region genes PCR-DGGE of bacteria of the ileal chyme of broilers

續(xù)表5

圖3 肉雞盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-DGGE指紋圖譜Fig.3 PCR-DGGE fingerprints genes of the V3 region genes of 16S rDNA amplified from bacteria of cecal chyme of broilers

與對照組相比，屎腸球菌組肉雞空腸、回腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE指紋圖譜的條帶數顯著增加。且飼糧中添加屎腸球菌促進了L.ingluviei在空腸及E.faecium和E.thailandicus在回腸中的生長繁殖且促進了乳桿菌這種益生菌的生長。

與對照組相比，地衣芽孢桿菌組肉雞空腸、回腸及盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCRDGGE指紋圖譜的條帶數變化不顯著。但飼糧中添加地衣芽孢桿菌促進了L.agilis和L.salivarius在空腸內的生長，抑制了C.eutactus和C.irregulare在回腸中的生長。結果表明，地衣芽孢桿菌的添加促進了乳桿菌的生長繁殖，這與他人試驗結果相同［22－23］。

與對照組相比，丁酸梭菌組肉雞空腸、回腸及盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE指紋圖譜的條帶數變化不顯著。但飼糧中添加丁酸梭菌促進了L.aviaries在空腸及L.versmoldensis在回腸的生長繁殖;抑制了 L.ingluviei、L.gasseri ATCC33323、L.saerimneri、L.agilis在空腸及L.satsumensis、L.gasseri ATCC33323、E.cecorum、L.salivarius、C.eutactus，C.irregulare在回腸的生長繁殖。結果表明，飼糧中添加丁酸梭菌，促進了2類乳桿菌的生長繁殖，而抑制了大部分其他菌，其中也有乳桿菌，這說明丁酸梭菌在腸道中產生的代謝產物有著比較專一的作用菌群。

表6 肉雞盲腸食糜細菌16S rDNA V3區(qū)基因PCR-DGGE優(yōu)勢條帶測序結果Table 6 Sequencing results of the predominant bands cut from the 16S rDNA V3 region genes PCR-DGGE of bacteria of the cecal chyme of broilers

圖4 不同組42日齡肉雞空腸、回腸和盲腸中微生物數量比較分析Fig.4 Comparing microbial populations of jejunum，ileum，cecum between different groups of 42-day-old broilers

3.2 不同益生菌對肉雞不同腸段菌群數量的影響

由于PCR-DGGE的方法只能檢測腸道中數量比較豐富的細菌，一般為總細菌數量的1%或者更多的菌群才能被檢測。因此，同時采用qPCR技術檢測肉雞不同腸段中細菌菌群的數量變化情況與趨勢。且qPCR方法計算細菌菌群數量不需要傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)，省時省力的同時有效的提高了檢測的靈敏度。利用2種互補研究技術的優(yōu)勢，綜合分析了不同益生菌對肉雞胃腸道菌群結構的影響差異。本試驗中應用qPCR技術對不同腸段內細菌菌群數量分析發(fā)現飼糧添加不同益生菌產生了不同的影響效果。與對照組相比，屎腸球菌顯著增加了空腸和回腸細菌的菌群數量，地衣芽孢桿菌顯著增加了空腸和盲腸的細菌菌群數量;丁酸梭菌顯著增加了回腸的細菌菌群數量。說明肉雞在采食屎腸球菌后其空腸和回腸內細菌菌群數量得到增加，在采食地衣芽孢桿菌后其空腸和盲腸的細菌菌群數量得到增加，在采食丁酸梭菌后其回腸的細菌菌群數量增加。而這種增加可能是屎腸球菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌在肉雞腸道內產生了有益該類細菌生長繁殖的代謝產物所致［24］。

飼糧中添加不同的益生菌無論是對菌群種類還是菌群數量都產生了不同程度的影響，這與菌群種類以及宿主腸道的營養(yǎng)物質代謝都息息相關［25］。除此之外，腸道菌群作為異源物質，其與腸道黏膜免疫系統(tǒng)之間也存在著復雜的相互作用［26］。各種菌群之間的相互競爭、共生關系也對最終動物機體的變化起著至關重要的作用，這都需要我們進一步的探索。

4 結論

①飼糧添加不同益生菌對肉雞不同腸段菌群結構產生了不同的影響:其中添加屎腸球菌后回腸、空腸樣品PCR-DGGE指紋圖譜的條帶數增多，并促進了乳桿菌生長;地衣芽孢桿菌的添加也促進了乳桿菌的生長繁殖，而抑制了C.eutactus和C.irregulare的生長;丁酸梭菌的添加促進了L.aviaries在空腸及 L.versmoldensis在回腸的生長繁殖。

②飼糧添加不同益生菌對肉雞不同腸段菌群數量產生了不同的影響:其中添加屎腸球菌增加了空腸和回腸細菌的菌群數量;地衣芽孢桿菌增加了空腸和盲腸的細菌菌群數量;丁酸梭菌增加了回腸的細菌菌群數量。

③綜上所述，飼糧添加屎腸球菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌均不同程度地改善了肉雞腸道菌群結構。

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