馬志遠(yuǎn) 翁秀秀 李 飛* 李發(fā)弟，2 王維民 劉 婷

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730020;2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤 733300;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，蘭州 730070)

實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)是繼Northern印跡雜交、原位雜交和RNA保護(hù)酶技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種新的mRNA表達(dá)定量方法，與之前的技術(shù)相比具有準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性好等特點(diǎn)。在相對(duì)定量中選取表達(dá)穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因，可以校正不同樣品因RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率的差異而造成的定量結(jié)果差異［1］。但是，常見的內(nèi)參基因在不同的組織和不同生理狀態(tài)下表達(dá)并不穩(wěn)定［2-3］，如沒(méi)有針對(duì)試驗(yàn)要求進(jìn)行內(nèi)參基因的穩(wěn)定性檢驗(yàn)，目的基因的表達(dá)有可能被錯(cuò)估。

近年來(lái)，利用相對(duì)定量方法研究黏膜免疫及轉(zhuǎn)運(yùn)功能的文章發(fā)表較多(表1)［4-10］。由表1可知，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶 1(PGK1)、18S rRNA和 β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)基因是研究胃腸道黏膜常用的內(nèi)參基因，但是尚未有文獻(xiàn)報(bào)道這些內(nèi)參在湖羊小腸黏膜內(nèi)表達(dá)是否穩(wěn)定，有待研究。

小腸黏膜具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫屏障等功能［11］，研究腸黏膜有助于了解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、腸道功能及腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持過(guò)程。生產(chǎn)中，羔羊一般在42和84日齡進(jìn)行飼糧過(guò)渡(由母乳或代乳料向開食料過(guò)渡，由開食料向育肥料過(guò)渡)，營(yíng)養(yǎng)素是影響腸道發(fā)育與功能建立的關(guān)鍵因素，導(dǎo)致小腸黏膜形態(tài)、結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)功能在該時(shí)間點(diǎn)變化較大［12］，但該階段穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因有哪些尚不清楚。因此，本試驗(yàn)利用RT-PCR法，檢測(cè)候選內(nèi)參基因 GAPDH、PGK1、18S rRNA和ACTB在42和84日齡湖羊公羔小腸黏膜中表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出適用于湖羊小腸黏膜RT-RCR內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用金昌中天羊業(yè)純種湖羊公羔6只隨母補(bǔ)飼，7日齡開始補(bǔ)飼開食料，56日齡斷奶，繼續(xù)飼喂開食料至60日齡逐漸更換生長(zhǎng)料，過(guò)渡期10 d。分別于42和84日齡頸靜脈放血各屠宰3只，解剖腹部后棉線結(jié)扎分離十二指腸、空腸、回腸，去除食糜后用載玻片刮取各小腸腸段黏膜，迅速置于液氮冷凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 黏膜基因相對(duì)定量常用內(nèi)參基因Table 1 Common reference genes used in relative quantification ofmucosal genes

試驗(yàn)中所用到的儀器有Nanodrop核酸分析儀(Thermo，美國(guó))，F(xiàn)lexCycler2 PCR 儀(Biometra，德國(guó))，Bio-Rad CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad，美國(guó))。

試驗(yàn)中所用到的試劑藥品TriZol試劑盒(TransZol)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperM ix)以及定量試劑盒(TransStart Top Green qPCR Super-M ix)均由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈合成

將小腸黏膜樣于研缽內(nèi)加液氮磨碎后，取粉樣 0.10 g，加入 1 m L TransZol顛倒混勻，室溫靜置5 m in，加入200μm氯仿顛倒混勻，靜置3 m in，4℃離心(10 000×g)10 m in，取上清液500μL于新離心管內(nèi)，加入預(yù)冷異丙醇500μL，靜置10 m in后4℃離心(1 000×g)，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀后，加 60μL 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。所得RNA樣品利用Nanodrop核酸分析儀測(cè)定OD260nm/OD280nm檢測(cè)RNA純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)18S與28S條帶清晰，無(wú)雜質(zhì)污染。

cDNA第1條鏈按照TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperM ix說(shuō)明合成，反應(yīng)體系為:模板 1 μL，Oligo(d)T 1 μL，gDNA Remover 1 μL，2×TS Reaction M ix 10 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足20μL。FlexCycler2 PCR儀反應(yīng)條件為:42℃持續(xù)30 m in，85℃持續(xù)5 m in。反應(yīng)結(jié)束后利用GAPDH引物擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:模板1 μL，上、下游引物各 0.8 μL，Superm ix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃ 變性 15 s，56 ℃ 退火 20 s，72℃ 延伸15 s，25個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段清晰，無(wú)雜質(zhì)污染，表明樣品反轉(zhuǎn)成功。cDNA樣按照OD計(jì)算稀釋至同一濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選管家基因及引物設(shè)計(jì)

候選基因 GAPDH、PGK1、18S rRNA、ACTB引物通過(guò)Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段特異性好，無(wú)引物二聚體(圖1)。引物由上海生工合成，信息見表2。

圖1 候選管家基因引物特異性擴(kuò)增Fig.1 The specific amplification of candidate housekeeping gene primers

表2 候選管家基因引物信息Table 2 Primer information of candidate housekeeping genes

1.4 RT-PCR

RT-PCR在Bio-Rad CFX96TMReal-Time System進(jìn)行。反應(yīng)體系按TransStart Top Green qPCR SuperM ix說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)體系為:模板1μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperM ix 10 μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 補(bǔ)足 20μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性15 s，63℃退火20 s，72 ℃延伸 15 s，41個(gè)循環(huán)。從 56～95 ℃，每循環(huán)增加0.5℃，持續(xù)0.05 s獲得解鏈溫度，采集熔解曲線熒光信號(hào)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證

將稀釋至相同濃度的cDNA模板按1、1/5、1/25、1/125、1/625倍連續(xù)稀釋 5個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用CFX ManagerTMSoftware分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)、斜率、擴(kuò)增效率，詳見表3。

引物擴(kuò)增效率計(jì)算方程式如下:

擴(kuò)增效率=10-(1/斜率)-1。

表3 候選管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、斜率、擴(kuò)增效率Table 3 R2，slope and amplification efficiency of standard curves of candidate housekeeping genes

1.6 數(shù)據(jù)分析

候選管家基因表達(dá)的穩(wěn)定性利用ΔCt法［13］、geNorm 軟件［14］、BestKeeper軟件［15］進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 不同小腸腸段和日齡Ct的比較

Ct越小，基因的表達(dá)豐度越高，反之，基因表達(dá)豐度越低。由圖2和圖3可知，18S rRNA的表達(dá)豐度是4個(gè)候選基因中最高的，GAPDH和ACTB較低，PGK1居中。在不同的小腸腸段黏膜中，PGK1和ACTB表達(dá)較為穩(wěn)定，不同日齡4個(gè)候選基因的表達(dá)都較穩(wěn)定，以ACTB為最。

2.2 geNorm 軟件、ΔCt法分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

由表4可知，geNorm軟件M值得出穩(wěn)定性排名為 ACTB=PGK1＞GAPDH＞18S rRNA，ΔCt法得出排名為 ACTB＞PGK1＞18S rRNA＞GAPDH、平均標(biāo)準(zhǔn)差排名為 ACTB＞18S rRNA＞PGK1＞GAPDH。

圖2 候選管家基因在不同小腸腸段的黏膜中Ct的比較Fig.2 Comparison of Ct of candidatemucosal housekeeping genes in small intestinal tract compartments

圖3 候選管家基因在不同日齡的小腸黏膜中Ct比較Fig.3 Comparison of Ct of candidatemucosal housekeeping genes in small intestine at different days of age

表4 geNorm軟件、ΔCt法分析候選管家基因穩(wěn)定性排序Table 4 Stability ranking of the candidate housekeeping genes by geNorm software andΔCtmethod

2.3 BestKeeper軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

由表5可知，根據(jù)變異系數(shù)可以看出，Best-Keeper軟件分析內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)镻GK1=ACTB＞18S rRNA＞GAPDH。

3 討論

在腸隱窩中存在大量多功能干細(xì)胞保證腸黏膜細(xì)胞快速持續(xù)更新，新生腸上皮細(xì)胞在向絨毛層遷移的過(guò)程中逐漸分化成熟，最終死亡脫落進(jìn)入消化管內(nèi)［11］。針對(duì)隱窩干細(xì)胞及黏膜功能細(xì)胞的研究有助于腸道疾病的治療及腸道功能機(jī)理的揭示，目前大量腸道分子機(jī)理研究都應(yīng)用了RTPCR技術(shù)［4-10］，涉及到黏膜這類含多種組織的器官時(shí)，選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

表5 BestKeeper軟件分析候選管家基因穩(wěn)定性(表達(dá)豐度交叉點(diǎn))Table 5 Stability of candidate housekeeping genes by BestKeeper software(cross points of expression level)

目前用于篩選內(nèi)參基因常用的軟件有g(shù)eNorm軟件、BestKeeper軟件以及ΔCt法等。geNorm軟件錄入的數(shù)據(jù)為相對(duì)表達(dá)豐度(2-ΔCt，ΔCt為每個(gè)基因不同樣本Ct與其中最小Ct之差)，M值是單個(gè)內(nèi)參基因與其他內(nèi)參基因表達(dá)豐度的兩兩比值后的對(duì)數(shù)變換從而計(jì)算出的平均標(biāo)準(zhǔn)差，M值越小穩(wěn)定性越好;BestKeeper軟件計(jì)算得出表達(dá)豐度交叉點(diǎn)(CP)的平均值、最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，CP的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定，反之越不穩(wěn)定。此外BestKeeper軟件還可以錄入目標(biāo)基因的Ct數(shù)據(jù)，對(duì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因進(jìn)行單獨(dú)分析;ΔCt法通過(guò)計(jì)算各內(nèi)參之間的平均標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，標(biāo)準(zhǔn)差越小穩(wěn)定性越好。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同類型細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且不受內(nèi)外源因素影響，常見的內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定性差異較大［16-17］，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4種候選基因在小腸各段間以及不同時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)穩(wěn)定性存在差異，3種方法計(jì)算的候選基因穩(wěn)定性排名各不相同，但ACTB排名均靠前。

GAPDH和PGK1是糖酵解及糖異生過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因，是常見的內(nèi)參基因，但是，在特殊條件下作為內(nèi)參存在缺陷。黏膜細(xì)胞供能主要依靠谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)氧化［18-19］，本試驗(yàn)中GAPDH在不同腸段內(nèi)表達(dá)豐度并不穩(wěn)定，3種內(nèi)參穩(wěn)定性分析法得出GAPDH穩(wěn)定性排名均較次可能與此有關(guān)。PGK1在本試驗(yàn)中表達(dá)較穩(wěn)定，但是該基因在胰腺導(dǎo)管腺癌［20］、結(jié)腸癌［21］等多種癌變細(xì)胞中表達(dá)豐度升高，且該基因在腸道炎癥病變條件下表達(dá)不穩(wěn)定［22］。

18S rRNA合成調(diào)節(jié)獨(dú)立于mRNA，一般情況下其表達(dá)豐度較穩(wěn)定，但是在有絲分裂時(shí)期，18S rRNA 表達(dá)豐度會(huì)降低［23］。本試驗(yàn)中，42～84日齡是小腸快速發(fā)育時(shí)期，其在不同腸段上表達(dá)存在較大差異，可能與發(fā)育過(guò)程中有絲分裂強(qiáng)弱有關(guān)。此外，18S rRNA的表達(dá)豐度高，Ct較低，與目標(biāo)基因的 ΔCt較大，也是其作為內(nèi)參基因的缺陷［2］。

ACTB是組成細(xì)胞的骨架蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定［24］，但是也有報(bào)道指出，其在成纖維細(xì)胞［25］，仔豬的心臟、肝臟、脾臟［26］，山羊的肝臟、皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌中表達(dá)穩(wěn)定性較差［27］。在本試驗(yàn)中，ACTB在各腸段各時(shí)間點(diǎn)上表達(dá)最穩(wěn)定，在3種不同分析方法下排名也最穩(wěn)定。董曉麗等［28］通過(guò)篩選幼齡小鼠腸道內(nèi)參后發(fā)現(xiàn)，幼齡小鼠小腸發(fā)育過(guò)程中，ACTB的穩(wěn)定性高于GAPDH，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

本試驗(yàn)羔羊均從56日齡斷奶，7日齡開始補(bǔ)飼開食料，60日齡逐漸更換生長(zhǎng)料，內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性是否與斷奶日齡及飼糧有關(guān)有待進(jìn)一步研究;本試驗(yàn)僅選取28和84日齡湖羊羔羊小腸黏膜樣品檢驗(yàn)內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定性，ACTB是否適用于湖羊整個(gè)生理階段有待證明。

4 結(jié)論

綜上，利用RT-PCR研究湖羊小腸黏膜的內(nèi)參基因最佳選擇為ACTB，其次為PGK1。18S rRNA和GAPDH表達(dá)的穩(wěn)定性較差，不適宜作為小腸黏膜研究?jī)?nèi)參基因。

［1］ GINZINGER D G.Gene quantification using real-time quantitative PCR:an emerging technology hits themainstream［J］.Experimental Hematology，2002，30(6):503-512.

［2］ ZHENG W J，SUN L.Evaluation of housekeeping genes as references for quantitative real time RT-PCR analysis of gene expression in Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2011，30(2):638-645.

［3］ WANG E L，WANG K Y，CHEN D F，et al.Evaluation and selection of appropriate reference genes for real-time quantitative PCR analysis of gene expression in Nile Tilapia(Oreochromis niloticus)during vaccination and infection［J］.International Journal of Molecular Sciences，2015，16(5):9998-10015.

［4］ HIROSHIO，TAKADA K，SUNDEN Y，et al.CD4+T cell cytokine gene and protein expression in duodenalmucosa of dogs w ith inflammatory bow el disease［J］.The Journal of Veterinary Medical Science，2014，76(3):409-414.

［5］ WATERSSM，KEOGH K，BUCKLEY F，etal.Effect of genotype on duodenal expression of nutrient transporter genes in dairy cows［J］.Journal of Animal Science and Biotechnology，2013，4:49-58.

［6］ 歐陽(yáng)五慶.動(dòng)物生理學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2010.

［7］ 王彩蓮.0～56日齡放牧綿羊消化系統(tǒng)發(fā)育變化的研究［D］.博士學(xué)位論文.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［8］ SAPONE A，LAMMERS K M，CASOLARO V，et al.Divergence of gut permeability and mucosal immune gene expression in two gluten-associated conditions:celiac disease and gluten sensitivity［J］.BMC Medicine，2011，9:23.

［9］ LUNDGREN A，STR?MBERG E，SJ?LING ?，et al.M ucosal FOXP3-expressing CD4+CD25 high regulatory T cells in helicobacter pylori-infected patients［J］.Infection and Immunity，2005，73(1):523-531.

［10］ GRIGORYAN M，KEDEESM H，CHARRON M J，et al.Regulation of mouse intestinal L cell progenitors proliferation by the glucagon fam ily of peptides［J］.Endocrinology，2012，153(7):3076-3088.

［11］ BALLENTM，W ILKENSM R，MATé L，etal.P-glycoprotein in sheep liver and small intestine:gene expression and transport efflux activity［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2013，36(6):576-582.

［12］ JIANG R，SHIZ G，JOHNSON J J，et al.Kallikrein-5 promotes cleavage of desmoglein-1 and loss of cellcell cohesion in oral squamous cell carcinoma［J］.Journal of Biological Chem istry，2011，286(11):9127-9135.

［13］ SILVER N，BEST S，JIANG J，et al.Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR［J］.BMC Molecular Biology，2006，7:33.

［14］ VANDESOMPELE J，De PRETER K，PATTYN F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RTPCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］.Genome Biology，2002，3(7):RESEARCH0034.

［15］ PFAFFL M W，TICHOPAD A，PRGOMET C，et al.Determ ination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity:bestkeeper-excel-based tool using pair-w ise correlations［J］.Biotechnology Letters，2004，26(6):509-515.

［16］ SCHM ITTGEN T D，ZAKRAJSEK B A.Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression:validation by real-time，quantitative RT-PCR［J］.Journal of Biochem ical and Biophysical Methods，2000，46(1-2):69-81.

［17］ LEE M A，GUO R Y，EBENEZER V，etal.Evaluation and selection of reference genes for ecotoxicogenom ic study of the green alga Closterium ehrenbergii using quantitative real-time PCR［J］.Ecotoxicology，2015，24(4):863-872.

［18］ FINCH L R，HIRD F JR.The uptake of am ino acids by isolated segments of rat intestine Ⅱ.A survey of affinity for uptake from rates of uptake and competition for uptake［J］.Biochim ica et Biophysica Acta，1960，43:278-287.

［19］ RAO R，CHAUDHRY K.Glutam ine protects GI epithelial tight junctions［M］//RAJENDRAM R，PREEDY V R，PATEL V B.Glutam ine in clinical nutrition.New York:Springer，2015:323-337.

［20］ PROFESSOR T L H，LIANG Y，CHIEN K-Y，et al.Overexpression and elevated serum levels of phosphoglycerate kinase 1 in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Proteom ics，2006，6(7):2259-2272.

［21］ ZIEKER D，K?NIGSRAINER I，TRITSCHLER I，et al.Phosphoglycerate kinase 1 a promoting enzyme for peritoneal dissem ination in gastric cancer［J］.International Journal of Cancer，2010，126(6):1513-1520.

［22］ KRZYSTEK-KORPACKA M，DIAKOWSKA D，BANIA J，et al.Expression stability of common housekeeping genes is differently affected by bowel inflammation and cancer:implications for finding suitable normalizers for inflammatory bowel disease studies［J］.Inflammatory Bowel Diseases，2014，20(7):1147-1156.

［23］ LOSSOS IS，CZERW INSKID K，WECHSER M A，et al.Optim ization of quantitative real-time RT-PCR parameters for the study of lymphoid malignancies［J］.Leukem ia，2003，17(4):789-795.

［24］ 董恩妮，梁青，李利，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇［J］.中國(guó)畜牧雜志，2013，49(11):92-96.

［25］ 王子?xùn)|.亞麻脂肪酸去飽和酶基因FAD3B表達(dá)載體構(gòu)建、鑒定與表達(dá)研究及牛轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)［D］.碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué)，2012.

［26］ 臺(tái)玉磊，韓立強(qiáng)，楊國(guó)慶，等.仔豬組織基因表達(dá)中實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的選擇［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18(4)732-736.

［27］ NAJAFPANAH M J，SADEGHIM，BAKHTIARIZADEH M R.Reference genes selection for quantitative real-time PCR using RankAggreg method in different tissues of capra hircus［J］.PLoS One，2013，8(12):e83041.

［28］ 董曉麗，王加啟，卜登攀，等.幼齡小鼠小腸組織內(nèi)參基因的選擇［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(5):20-24，29.