劉立坤，高會(huì)霞，李永乾

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院輸血科，河北 石家莊050051；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊050021）

目前，標(biāo)準(zhǔn)的血小板保存條件只有常溫（22±2）℃振蕩保存和二甲亞砜冷凍保存，儲(chǔ)存不足限制了血小板臨床應(yīng)用。有體外實(shí)驗(yàn)證明，室溫中保存的血小板容易失去止血功能［1］。血小板在保存期內(nèi)的活化和凋亡可能是導(dǎo)致血小板功能降低，影響血小板輸注效果的重要因素。因此，保護(hù)血小板活性、提高其體外的存活率是血小板保存面臨的重要問題。本研究將血小板在不同的溫度下懸浮于添加液與血漿的混合液中，觀察其保存期內(nèi)的活化和凋亡情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 血小板添加液成分：海藻糖75.00g／L、Na2HPO43.05g／L、KCl 0.37g／L、NaH2PO4·2H2O 1.05g／L、NaCl 4.05g／L、MgCl2·6H2O 0.30g／L、Na3枸櫞酸·2H2O 3.18 g／L［2］；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（日本Sysmex公司）；流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 血小板的制備及保存 取20份單采血小板，每份均一分為三，一份貯存于（22±2）℃振蕩器（對(duì)照組），其余二份離心（1 000g，10min），保留35%血漿，加入65%的血小板添加液混勻，分別保存于10℃靜置冷藏（實(shí)驗(yàn)Ⅰ組）及（22±2）℃振蕩儀（實(shí)驗(yàn)Ⅱ組）。

1.3 血小板質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè) 血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)（platelet count，PLT）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板CD62p和△Ψm［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，3組PLT比較平穩(wěn)，在組間、時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著時(shí)間延長(zhǎng)CD62p逐漸升高，而△Ψm%逐漸下降，3組CD62p、△Ψm在組間、時(shí)點(diǎn)間以及組間·時(shí)點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1～3。

表1 3組PLT不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表1 3組PLT不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表2 3組CD62P不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表2 3組CD62P不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表3 3組△Ψm不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

表3 3組△Ψm不同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

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3 討 論

血小板是人體凝血機(jī)制中重要的血液成分，其體積小，無細(xì)胞核，但卻存在明顯的凋亡現(xiàn)象，影響輸注后體內(nèi)的存活率［4］。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定懸浮在自體血漿的單采血小板在（22±2）℃振蕩保存僅有5d的有效期，造成臨床供應(yīng)不足。現(xiàn)在面臨的難題是血小板的保存時(shí)間越長(zhǎng)越容易發(fā)生血小板的儲(chǔ)存損傷，血小板不斷激活，釋放一系列炎性因子，并引起血小板凋亡，其功能和體內(nèi)存活率大大降低，影響臨床治療效果，甚至輸注無效［1］。

血小板在活化時(shí)可分泌和表達(dá)一系列特異性蛋白，特別是血小板膜表面糖蛋白CD62p，它是血小板a顆粒膜蛋白，在靜息血小板中CD62p僅分布于a顆粒膜上，血小板活化時(shí)a顆粒膜蛋白快速與質(zhì)膜融合并在血小板表面持久表達(dá)，與中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞膜上的CD62p糖蛋白配體1結(jié)合，驅(qū)動(dòng)淋巴細(xì)胞亞群的遷移與錨定，它是目前最具特性的血小板活化分子標(biāo)志物［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板膜表面糖蛋白CD62p的高表達(dá)可能與血小板在體內(nèi)循環(huán)中被快速清除有關(guān)［5］。Holme等［6］認(rèn)為CD62P表達(dá)＜30%時(shí)血小板體內(nèi)活力較好，CD62p表達(dá)＞60%時(shí)其體內(nèi)活力極低。本研究觀察到：3組CD62p表達(dá)率都是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，1～3d時(shí)實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的CD62p表達(dá)率與對(duì)照組差別不大，而5～7d時(shí)對(duì)照組CD62p表達(dá)最低，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組次之，實(shí)驗(yàn)Ⅱ組最大（但3組CD62p表達(dá)率均＜60%），這提示血小板懸浮在血小板添加液比懸浮于自身血漿中可能更容易激活，其原因目前尚不清楚，推測(cè)可能與血漿中含有激活抑制因子有關(guān)［7］；但在相同血小板添加液中貯存血小板的實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（10℃）CD62p表達(dá)率低于實(shí)驗(yàn)Ⅱ組（22℃），說明低溫保存對(duì)血小板的活化有保護(hù)作用。血小板保存期間不僅CD62p表達(dá)增加，而且還會(huì)釋放一些細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B1、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1B等，這些細(xì)胞因子可能導(dǎo)致無抗體調(diào)節(jié)的輸血反應(yīng)［8］。單采血小板的活化程度和保存期間細(xì)胞因子的釋放是由血小板添加液的性質(zhì)和保存溫度等綜合因素決定的［7］。本研究用65%血小板添加液混合35%血漿來保存血小板，觀察7 d內(nèi)血小板的體外功能。血小板添加液中海藻糖能很好地抑制寒冷導(dǎo)致的血小板變形聚集，是一種非常有研究潛力的低溫血小板保護(hù)劑［9］，少量的血漿可以提供血小板代謝所需要的底物。用血小板添加液混合血漿保存血小板，可以降低血漿使用比例，還可以降低血液傳染病毒和其他病原體的可能，但對(duì)血小板的激活抑制作用稍差于血漿保存的對(duì)照組，在這方面仍有待于研究改進(jìn)。

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，是一種主動(dòng)的、程序性的由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式。越來越多的證據(jù)表明，線粒體是凋亡的執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動(dòng)中心，所以線粒體是參與細(xì)胞凋亡過程的一種重要細(xì)胞器，線粒體外膜的高通透性使得線粒體內(nèi)外膜間隙內(nèi)的環(huán)境與胞質(zhì)中的環(huán)境幾乎相似。與外膜不同的是，其內(nèi)膜的蛋白質(zhì)／脂質(zhì)比較高，心磷脂的含量同樣較高，但膽固醇及其缺乏，這就形成了線粒體內(nèi)膜對(duì)離子的不可滲透性，即內(nèi)膜通透性屏障（不能通過相對(duì)分子質(zhì)量＞15 000的物質(zhì)）。在氧化呼吸過程中線粒體形成橫跨線粒體內(nèi)膜的跨膜電位△Ψm，而△Ψm的變化與細(xì)胞線粒體內(nèi)膜通透性密切相關(guān)。有研究報(bào)道許多生理或非生理因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均存在△Ψm降低，凋亡可能是導(dǎo)致庫存血小板失活的重要因素，而溫度又是血小板凋亡的影響因素［3］。線粒體△Ψm去極化是血小板凋亡的早期表現(xiàn)和特征性改變。本研究分別在10℃及22℃左右的溫度保存血小板7d，觀察△Ψm去極化的情況，試圖揭示低溫對(duì)血小板凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板的早期凋亡率顯著增加。實(shí)驗(yàn)Ⅰ組與實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的保存液相同，但溫度有所不同，與實(shí)驗(yàn)Ⅱ組［（22±2）℃］相比，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（10℃）儲(chǔ)存的血小板的凋亡程度最低，表明10℃低溫對(duì)血小板起到了很好的保護(hù)作用。

本研究初步揭示了血小板在血小板添加液及低溫條件下體外保存時(shí)的活化和凋亡情況，為選擇合適的血小板保存液和保存溫度提供了初步依據(jù)，隨著血小板保護(hù)劑和保存條件的深入研究，將會(huì)更加有效地抑制血小板的活化和凋亡，血小板的保存時(shí)間將會(huì)有效延長(zhǎng)。

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