王 磊，胡晨曦，夏鈾鈾，宋大安，黎世秋，蔣曉東

（江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院腫瘤放療科 222002）

胰腺癌是惡性程度高、進展快、預后極差的消化道惡性腫瘤，80%患者臨床確診時已處于中晚期，70%～80%死于廣泛轉(zhuǎn)移［1］。而放射治療是中晚期胰腺癌姑息治療的主要手段，并成為延長生存期的有效手段［2］。臨床資料證實，放療對于提高胰腺癌的局部控制率及改善臨床癥狀有著明顯優(yōu)勢。但是胰腺癌細胞對放射治療不敏感，極易局部復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。而近年研究表明，腫瘤存在干性細胞，且是導致其復發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療耐受的根源［3］。本研究利用流式細胞儀對PANC－1細胞株進行檢測并分選，得到該細胞株中的CD44＋CD24＋干性細胞亞群和其他3個亞群；通過檢測各亞群細胞經(jīng)射線照射后的克隆形成、細胞凋亡、周期分布和活性氧簇（ROS）水平，分析各亞群細胞的放射敏感性，并初步探討胰腺癌干性細胞放射抗拒的可能機制。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 人胰腺癌細胞PANC－1購自中國科學院上海生命科學研究院；DMEM培養(yǎng)基、DMEM／F－12培養(yǎng)基及B27添加劑均購自美國GIBCO公司；標準胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；細胞凋亡及周期分布試劑盒購自南京凱基生物公司；DCFH－DA熒光探針購自美國的Sigma公司；流式細胞儀購自美國Beckman－Coulter公司；直線加速器購自德國Siemens Primus公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng)與照射條件 培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清（FBS）的DMEM／F－12完全培養(yǎng)液（含1%的青霉素和鏈霉素），5%的CO2、恒溫37℃培養(yǎng)箱。照射條件：使用德國Siemens Primus直線加速器，6MV X射線室溫下源皮距照射，劑量率為300cGy／min，六孔板上方覆蓋1．5cm劑量補償墊，固定源皮距，SSD＝100cm，機架角度為0°，射野大小為15cm×15cm，單次照射。

1．2．2 流式細胞儀檢測及分選 細胞生長到對數(shù)生長期后，棄培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入無EDTA胰酶于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化2min，待細胞變圓后加入含血清的培養(yǎng)基5mL左右終止消化，吹打混勻后移入無菌離心管，1 500r／min離心5min，棄上清。細胞沉淀用PBS 1次，加入CD24－PE、CD44－FITC（1∶100稀釋）于4℃冰箱輕搖孵育1h，1 000r／min離心5 min，棄上清，用PBS洗1次，500μL PBS懸浮，流式細胞分選儀進行分選，分選后細胞培養(yǎng)用含10%FBS的DMEM／F－12完全培養(yǎng)液（含1%的青霉素和鏈霉素及B27），放于37℃的CO2培養(yǎng)箱。

1．2．3 流式細胞術測細胞凋亡 分選后的各組細胞經(jīng)射線照射（照射劑量為2Gy）24h后，用無EDTA胰酶消化成細胞懸液，收集照射處理前后的細胞，冷的PBS洗滌2次（1 500r／min離心5min），棄上清，用100μL Annexin V－FITC binding buffer重懸細胞，再分別加入5μL Annexin V－FITC和PI，4℃避光反應30min，再加入400μL的binding buffer混勻后利用流式細胞儀檢測。

1．2．4 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的各胰腺癌亞群細胞，按一定數(shù)量（102～105個／孔）接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，室溫下予X線照射。照射劑量分別為0、2、4、6、8Gy。繼續(xù)培養(yǎng)10～14d，鏡下計數(shù)大于或等于50個細胞的克隆數(shù)。終止培養(yǎng)，固定，快速Giemsa染色，按說明書操作，將培養(yǎng)板倒置并疊加一張帶有網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計數(shù)直徑大于或等于0．2mm的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕剩≒E）＝克隆數(shù)／接種細胞數(shù)×100%，細胞存活分數(shù)（SF）＝實驗組PE／0Gy組PE×100%，計算各放射劑量點的SF，根據(jù)單擊多靶模型［S＝1－（1－eD／D0）N］以 GraphPad prism5繪圖軟件進行曲線擬合作圖。實驗重復3次。放射增敏比（SER）＝Dq（CD44＋CD24＋）／Dq（CD44＋CD24－、CD44－CD24＋、CD44－CD24－），Dq＝D0×lnN。

1．2．5 細胞周期分析 處理同1．2．3，收集照射處理前后的細胞，70%冷乙醇固定，4℃24h，將固定后的細胞用PBS洗滌1次，100μL RNAase 37℃水浴30min，離心后加入400μL PI 4℃避光30min，流式細胞儀檢測。實驗重復4次。

1．2．6 細胞內(nèi)ROS測定 處理同1．2．3，收集照射處理前后的細胞，細胞用溫PBS洗1次，加入1mL無血清培養(yǎng)基配置的DCFH－DA（10μmol／L），恒溫37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，棄培養(yǎng)基，加入溫PBS洗3次，無EDTA胰酶消化成細胞懸液，1 500r／min離心5min，棄上清，用PBS懸浮，流式細胞儀檢測波長（使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長），結果用平均熒光強度（MFI）表示。實驗重復4次。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16．0軟件行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析及t檢驗。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 PANC－1細胞中各細胞占比例 PANC－1細胞中CD44＋細胞比例約為92．0%，CD24＋細胞比例約為4．7%，CD44＋CD24＋（0．6±0．2）%、CD44＋CD24－（89．3±2．6）%、CD44－CD24＋（4．1±1．3）%和CD44－CD24－（6．0±1．7）%。見圖1。

圖1 PANC－1細胞內(nèi)各亞群所占比例情況

2．2 各細胞亞群凋亡情況 放射線照射前，CD44＋CD24＋（3．3±0．6）%、CD44＋CD24－（4．0±0．8）%、CD44－CD24＋（3．4±0．7）%和CD44－CD24－（3．5±0．8）%，各組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。放射線照射24h后，CD44＋CD24＋（6．8±1．1）%、CD44＋CD24－（10．4±2．7）%、CD44－CD24＋（13．0±3．1）% 和 CD44－CD24－（26．3±2．4）%，CD44＋CD24＋凋亡比例最低（P＜0．05）。見圖2。

圖2 放射線照射前后各亞群細胞凋亡情況

圖3 各亞群細胞克隆形成實驗

2．3 各亞群細胞克隆形成實驗分析 經(jīng)2、4、6、8Gy劑量X射線照射后，CD44＋CD24＋、CD44＋CD24－、CD44－CD24＋、CD44－CD24－的SF發(fā)生不同程度改變，其中CD44＋CD24＋SF下降幅度最低，CD44＋CD24－與CD44－CD24＋次之，CD44－CD24－下降最明顯，見圖3。

2．4 各亞群細胞周期分布 放射線照射前后，CD44＋CD24＋的G0／G1期比例均最高，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。見表1。

2．5 各細胞內(nèi)ROS水平 放射線照射前，CD44－CD24－ROS水平最低，MFI低于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。放射線照射24h后，CD44＋CD24＋ROS水平最低，MFI低于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。見圖4。

表1 放射線照射前后各亞群細胞周期分布（x±s）

圖4 放射線照射前后各亞群細胞內(nèi)ROS水平

3 討 論

胰腺癌對放射治療不敏感，甚至表現(xiàn)出抗拒，導致其預后差。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)胰腺癌干性細胞是導致腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源［4］。本課題研究證實，胰腺癌干性細胞的放射抗拒的原因可能與干細胞大多處于靜止期，且干性細胞內(nèi)低ROS水平有關。

腫瘤干細胞學說認為［5－11］，腫瘤組織中存在極少量的瘤細胞，在腫瘤中充當干性細胞的角色，這些細胞具有無限增殖的潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著決定性作用。Huang等［12］應用流式細胞儀在胰腺癌PANC－1細胞株中分選出CD44＋CD24＋細胞，發(fā)現(xiàn)其在體外增殖率低于CD44－CD24－細胞，但成瘤率高20倍，認為PANC－1中CD44＋CD24＋細胞有腫瘤干性細胞的特性，因此本課題選取此細胞株為研究對象，開展了一系列的研究。經(jīng)過流式檢測和分選，獲得了4個亞群的細胞。本實驗所分選出的CD44＋細胞比例明顯高于Huang等［12］的實驗結果，原因有可能為細胞傳代次數(shù)多后，部分細胞存在變異可能。克隆形成實驗結果顯示CD44＋CD24＋SF下降幅度最低，CD44＋CD24－與 CD44－CD24＋次之，CD44－CD24－下降最明顯（SER＝1．94）；在檢測凋亡的實驗中，放射線照射前，4組細胞凋亡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），而照射24h后CD44＋CD24＋細胞的凋亡比例最低，CD44－CD24－細胞凋亡最明顯，結合以上兩項結果表明更具胰腺癌干性細胞特性的CD44＋CD24＋細胞對放射抗拒。周期結果顯示，放射線照射前后，CD44＋CD24＋的 G0／G1期比例最高，說明更具有腫瘤干性細胞特性的CD44＋CD24＋是一群相當靜止的細胞，有慢周期特點。腫瘤干性細胞自身處于靜止期，導致其放射抗拒。Lee等［13］通過CD44＋CD24＋ESA＋腫瘤干性細胞移植瘤模型也證實了胰腺癌干性細胞對放射化學治療抵抗。他們用放射治療聯(lián)合吉西他濱化療干預上述模型時發(fā)現(xiàn)移植瘤的生長不僅不被抑制反受到刺激。

實驗結果顯示，放射線照射前不具有胰腺癌干性細胞特性的CD44－CD24－ROS水平最低，MFI低于其他3組；而放射線照射24h后，CD44－CD24－ROS水平最高，而最具有干性細胞特性的CD44＋CD24＋ROS水平最低。ROS是一類含氧的比氧氣更加活潑的物質(zhì)，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2－）、羥自由基（OH－）等［14］。細胞內(nèi) ROS產(chǎn)生的一個重要來源是線粒體。ROS具有較高的反應活性，易于快速與細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應，引起與許多病理過程有關的細胞結構的廣泛損傷，進而觸發(fā)細胞凋亡。放射治療的主要生物學效應即是通過對組織水分子電離或激發(fā)產(chǎn)生活性很強的OH－，引起細胞DNA損傷或通過脂質(zhì)過氧化途徑誘導細胞凋亡［15］。腫瘤干性細胞的放射抗拒與其細胞內(nèi)的低ROS水平有關。腫瘤干性細胞高效率的DNA修復是化學治療和放射治療抵抗的重要機制；干性細胞得到細胞龕的保護等。胰腺癌為乏氧腫瘤，缺氧可上調(diào)端粒酶及CXCR4［16］的表達，因此，腫瘤的耐藥性、侵襲性增加。

以上研究表明，更具胰腺癌干性細胞特性的細胞亞群表現(xiàn)出對放射誘導的凋亡抗拒，且初步分析其可能原因為，胰腺癌干性細胞為一群相當靜止的細胞，其慢周期導致放射抗拒，此外干性細胞內(nèi)低ROS水平是導致其放射耐受的重要原因之一，為以后胰腺癌的治療提供新的靶點。

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