劉洋，劉碩，孫建軍

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論著·基礎(chǔ)

ApoG2聯(lián)合放療對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞自噬 與凋亡的影響研究

劉洋，劉碩，孫建軍

目的 探討ApoG2聯(lián)合放射治療對(duì)鼻咽癌(NPC)的CNE-2細(xì)胞自噬與凋亡的影響。方法 將人NPCCNE-2細(xì)胞株分成空白對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)、放射治療組、ApoG2組、聯(lián)合組(放射+ApoG2)，采用CCK-8法測定ApoG2+放射治療對(duì)細(xì)胞增敏的作用，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化，吖啶橙染色觀察細(xì)胞自噬形態(tài)變化，檢測細(xì)胞凋亡率的變化；Westernbolt檢測Beclin1、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況變化。結(jié)果 不同的放射劑量組間細(xì)胞增殖抑制率比較具有顯著性差異(P<0.01)，隨著放射劑量的增加，鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的抑制率也隨之上升；不同的ApoG2藥物濃度組間細(xì)胞增殖抑制率比較差異也具有顯著性意義(P<0.01)，隨著藥物濃度的增加，鼻煙癌CNE-2細(xì)胞的抑制率也上升。4組CNE-2細(xì)胞的凋亡率組間比較具有顯著性差異，聯(lián)合組凋亡率顯著高于其他3組(F=140.2，P<0.01)。4組的Bcl-2、Beclin1的蛋白表達(dá)量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Bel-2：F=71.24，P<0.01；Beclinl：F=107.53，P<0.01)，其中聯(lián)合組的Bcl-2蛋白表達(dá)量最低，Beclin1的蛋白表達(dá)量最高。結(jié)論ApoG2聯(lián)合放療能夠通過誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的自噬與凋亡，從而抑制CNE-2細(xì)胞的增殖。

ApoG2；鼻咽癌；CNE-2細(xì)胞；自噬；凋亡

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.016

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是發(fā)生于上咽喉部或鼻咽腔的一種惡性腫瘤，對(duì)我國人民的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。由于其解剖學(xué)特點(diǎn)和生物學(xué)行為比較特殊，對(duì)放射線較為敏感，故其主要的治療手段是放射治療[1，2]?；熕幬锎蠖鄶?shù)是通過對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其發(fā)生凋亡達(dá)到治療腫瘤的目的，目前有研究顯示在治療腫瘤的過程中自噬也扮演著重要的角色[3]。ApoG2(apogossyplone)作為小分子B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma，Bcl-2)的抑制劑，是新型的棉酚衍生物之一，在多種腫瘤的治療中表現(xiàn)出了良好的治療效果[4]。本文旨在通過對(duì)ApoG2聯(lián)合放射治療對(duì)NPC的CNE-2細(xì)胞增殖的抑制作用，探討此種治療手段對(duì)細(xì)胞自噬與凋亡的影響，給臨床治療NPC提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人NPC CNE-2細(xì)胞株： 由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。將人NPC CNE-2細(xì)胞株分成空白對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)、放射治療組、ApoG2組、聯(lián)合組(放射+ ApoG2)。

1.1.2 主要試劑： ApoG2(美國密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院)配成20 mmol/L母液于-20℃中避光保存，25 cm2和75 cm2的培養(yǎng)瓶，6、9孔板，15 ml和50 ml的離心管(Corning公司)，PBS溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)(HyClon公司)，H-DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClon公司)，胎牛牛血清(杭州四季青公司)，1×青鏈霉素(廣州捷倍斯生物科技有限公司)，Hoechst 33258染色試劑盒、CCK-8溶液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物產(chǎn)品)，BCA、PMSF、RIPA蛋白定量試劑盒(上海申能博彩生物公司)，預(yù)染蛋白Marker(Fermentas公司)，5×上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，beta-actin(上海艾比瑪特公司)，抗Bcl-2抗體、抗Beclin1抗體(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶二抗(武漢博士德公司)，PVDF膜(Millipore公司，美國)，ECL發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要設(shè)備： X膠片(柯達(dá)公司)，定影粉、顯影粉(廣州威佳科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： (1)細(xì)胞復(fù)蘇。解凍人NPC CNE-2細(xì)胞株凍存管，移至無菌操作臺(tái)，將細(xì)胞放置離心管內(nèi)，注入5 ml含1×青鏈霉素、10%滅活胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，將細(xì)胞輕輕吹打和洗滌，離心后將廢液除去；重懸細(xì)胞后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)。對(duì)人NPC CNE-2細(xì)胞的貼壁情況進(jìn)行觀察，每3天換1次液，若培養(yǎng)瓶底80%～90%被細(xì)胞長滿時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即先將培養(yǎng)液吸去，洗滌后加入0.25%的胰蛋白酶溶液(含EDTA)，將瓶底鋪滿，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育、消化5～7 min，取出置于顯微鏡下，對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)觀察。大量細(xì)胞一旦變圓時(shí)，為了終止細(xì)胞消化注入培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞懸液離心，除去廢液，重懸細(xì)胞，最后按照1∶4～1∶5進(jìn)行細(xì)胞的傳代處理。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制測試： 采用CCK-8法測定,消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞CNE-2，計(jì)數(shù)后重懸細(xì)胞，接種于96孔的培養(yǎng)板，消化后將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，接孔，每孔注入100 μl的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)后將舊培養(yǎng)液吸盡，分成空白對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)、放射治療組、ApoG2組、聯(lián)合組(放射+ ApoG2)，每組平行復(fù)孔4個(gè)。分別培養(yǎng)后將舊培養(yǎng)液吸盡，將新培養(yǎng)液注入，同時(shí)注入10 μl的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度A值，反復(fù)3次，依據(jù)抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白對(duì)照組的A值)/(對(duì)照組平均A值-空白對(duì)照組的A值)×100%，計(jì)算各組的增殖抑制率。

1.2.3 觀察細(xì)胞凋亡、自噬形態(tài)變化： Hoechst 33258染色觀察聯(lián)合治療下細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化和吖啶橙染色對(duì)聯(lián)合治療下細(xì)胞自噬形態(tài)的變化。消化、重懸對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞CNE-2，計(jì)數(shù)后依據(jù)1.5×105個(gè)/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)瓶底長滿50%～70%的細(xì)胞后將舊培養(yǎng)液吸盡，分為對(duì)照組(0.01%DMSO)，放射治療組(4 Gy)，ApoG2組(20 μmol/L)，聯(lián)合組(放射治療+ApoG2)。將100 μl的培養(yǎng)液加入每組中，聯(lián)合組及放射治療組照射4 Gy。培養(yǎng)后將舊培養(yǎng)液吸盡，加入固定液0.5 ml，均勻覆蓋孔板底，洗滌后將廢液吸盡，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml/1.0 mg-1·L-1吖啶橙染色，避光5 min/15 min后將廢液吸盡，在陰涼避光下保存，反復(fù)3次于顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)。

1.2.4 Western bolt蛋白印跡法檢測聯(lián)合治療下Beclin 1、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化： 依據(jù)上述的分組情況，待培養(yǎng)瓶底長滿50%～70%的細(xì)胞后將舊培養(yǎng)液吸盡，將100 μl的培養(yǎng)液加入每組中，聯(lián)合組及放射治療組照射4 Gy。培養(yǎng)、收集以及冰上裂解細(xì)胞后，將總蛋白收集，采用BCA法測定蛋白的濃度。用12%的SDS-PACE將蛋白分離，15 V半干轉(zhuǎn)膜儀，1 h后轉(zhuǎn)至PVDF上，封閉1 h后洗膜，加入已經(jīng)稀釋過的Bcl-2、Beclin1、β-actin多克隆抗體，再次封閉、洗膜，用稀釋過的辣根過氧化物酶二抗進(jìn)行1 h的反應(yīng)后洗膜，顯影定影后，分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖抑制率的比較 不同的放射劑量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，隨著放射劑量的增加，鼻咽癌CNE-2細(xì)胞抑制率也隨之上升。不同的ApoG2藥物濃度組間比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，隨著ApoG2濃度逐漸增加，鼻咽癌CNE-2細(xì)胞抑制率也隨之升高。見表1。

表1 ApoG2聯(lián)合放療對(duì)于CNE-2的生長抑制率 (%)

2.2 各組鼻咽癌CNE-2細(xì)胞凋亡率的比較 結(jié)果提示4組CNE-2細(xì)胞的凋亡率組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=140.2，P<0.01)，聯(lián)合組CNE-2細(xì)胞凋亡率顯著高于其他3組(P<0.01)。見表2。

表2 各組鼻咽癌CNE-2細(xì)胞凋亡和自噬的比較±s)

2.3 各組細(xì)胞自噬的比較 各組的Bcl-2、Beclin1的蛋白表達(dá)量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.24，F(xiàn)=107.53，P均<0.01)，其中聯(lián)合組的Bcl-2蛋白表達(dá)量最低，Beclin1的蛋白表達(dá)量最高。見表2，圖1。

圖1 各組Bcl-2、Beclin 1及β-actin蛋白表達(dá)比較

3 討 論

據(jù)相關(guān)研究資料顯示，細(xì)胞自噬和凋亡間的相互作用能共同對(duì)細(xì)胞的死亡起促進(jìn)作用。Bcl-2蛋白是對(duì)細(xì)胞凋亡起主要調(diào)控作用的蛋白，其過表達(dá)可以對(duì)細(xì)胞自噬的發(fā)生起有效地抑制作用[5]。其既可以對(duì)凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，也能對(duì)自噬構(gòu)成影響。其中Bcl-2蛋白引發(fā)的自噬與Beclin1蛋白可能相關(guān)。Beclin1蛋白存在BH3的結(jié)構(gòu)域，類似BH3的物質(zhì)可以競爭性地對(duì)抗Bcl-2與Beclin間的結(jié)合，可以釋放出Beclin1來促進(jìn)細(xì)胞的自噬。Bcl-2與Beclin間的結(jié)合能對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞具有的自噬能力進(jìn)行有效的抑制，但是突變型的Beclin1無法與Bcl-2蛋白結(jié)合，增強(qiáng)了細(xì)胞的自噬，加快了細(xì)胞的凋亡過程[6，7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外運(yùn)用ApoG2作用于NCLCNE-2細(xì)胞后，可以對(duì)細(xì)胞的生長進(jìn)行有效地抑制，明顯表現(xiàn)為劑量—時(shí)間的依賴性，抑制作用隨著劑量的上升而增強(qiáng)，隨著作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。此外體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也顯示，當(dāng)注射ApoG2第12天時(shí)將試驗(yàn)終止，腫瘤剝離，腫瘤稱量結(jié)果提示腫瘤受到明顯的抑制，提示無論體內(nèi)還是體外應(yīng)用ApoG2均可以對(duì)NCLCNE-2細(xì)胞有顯著的抑制效果[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)ApoG2可以引發(fā)Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞的凋亡，同時(shí)上調(diào)的Beclin1引發(fā)了自噬[9]，此與上述的結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于CNE-2細(xì)胞，放射治療與ApoG2以及其聯(lián)合作用，不同放射劑量間的比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其對(duì)NPCCNE-2細(xì)胞的抑制率隨著放射劑量的上升而上升。ApoG2的藥物濃度不同，其之間的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)應(yīng)的抑制率也隨著ApoG2藥物濃度的增加而上升[10]。這2個(gè)結(jié)果間有著一定的交互效應(yīng)，即在放射劑量不同的情況下，抑制率隨著ApoG2藥物濃度的增加而增強(qiáng)[11]；在ApoG2藥物濃度不同的情況下，抑制率同樣隨著放射劑量的上升而增強(qiáng)。ApoG2是能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行有效抑制的一種藥物。通過蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)率有所降低，其中聯(lián)合組的表達(dá)量最低；Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量上升，而聯(lián)合組中最高。ApoG2可以促進(jìn)放療治療對(duì)NCL的敏感性，可能的機(jī)制與下調(diào)的Bcl-2蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，上調(diào)的Beclin1蛋白對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行誘導(dǎo)相關(guān)。在細(xì)胞的凋亡與自噬中，Beclin1蛋白起著重要的作用，其存在BH3結(jié)構(gòu)域，類似BH3的物質(zhì)可以競爭性地對(duì)抗Bcl-2與Beclin1的結(jié)合[12]。

總之，ApoG2可以協(xié)同增加放射治療對(duì)NCL的敏感性，對(duì)NCL的生長進(jìn)行有效地抑制，通過上調(diào)Beclin1蛋白的表達(dá)量以及下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)量對(duì)細(xì)胞的自噬與凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，最終致使細(xì)胞死亡。

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The study of the effect of ApoG2 combined with radiotherapy onautophagy and apoptosis of CNE 2 cells of nasopharyngeal carcinoma

LIUYang,LIUShuo,SUNJianjun.

DepartmentofENT,theGeneralNavyHospital,Beijing100048,China

SUNJianjun,E-mail:jjsun85@sina.com

Objective To investigate the effect of ApoG2 combined with radiotherapy on CNE 2 cell autophagy and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Human NPC CNE were divided into blank control group (only 2 cell lines with medium, without the addition of cells) and radiotherapy group, ApoG2 group, combination group (radiotherapy + ApoG2), to determine the treatment sensitizing effects on cell growth of ApoG2+ radiation by using the method of CCK was 8, Hoechst 33258 staining was used to observe the changes of cell apoptosis morphology of autophagy, observe the morphological changes of acridine orange staining; cell apoptosis rate changes were detected, Western bolt detection were used to detect the expression of Beclin1, Bcl 2 protein changes.Results There was significant difference of cell proliferation inhibition rate between different radiation dose group (P<0.01),withtheincreaseofradiationdoses,nasopharyngealcarcinomaCNE2cellinhibitionratealsoincreased;differentApoG2drugconcentrationgroupamongthecellproliferationinhibitionratealsohassignificantdifference(P<0.01),withtheincreaseofdrugconcentration,CNEinhibited2nasopharyngealcarcinomacellrateincreased. 4groups’CNE2cellsapoptosisrateofrevealedsignificantdifferenceswithingroups(F=140.2,P<0.01),apoptosisrateofcombinedgroupwassignificantlyhigherthantheother3groups(P<0.01). 4groupsofBcl2 (F=71.24,P<0.01),Beclin1 (F=107.53,P<0.01)proteinexpressionwasstatisticallysignificantdifferencesbetweengroups,thejointgroup’sBcl2proteinexpressionwasthelowest,theexpressionofBeclin1proteinwasthehighest.Conclusion ApoG2 combined with radiotherapy can through autophagy and apoptosis induction of nasopharyngeal carcinoma CNE 2 cell to inhibit the proliferation of CNE 2 cells.

ApoG2; Nasopharyngeal carcinoma; CNE2 cells; Autophagy; Apoptosis

100048 北京，解放軍海軍總醫(yī)院耳鼻喉科

孫建軍，E-mail:jjsun85@sina.com

2014-12-10)