仕海濤

[摘要] 目的 建立扶正化積合劑的質(zhì)量控制方法。 方法 對扶正化積合劑中黃芪、淫羊藿、三七進行薄層色譜鑒別；采用高效液相色譜法對黃芪甲苷進行含量測定。 結(jié)果 扶正化積合劑中黃芪、淫羊藿、三七的薄層色譜均斑點清晰，陰性對照無干擾；黃芪甲苷進樣量在0.2102～4.2040 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9997），平均回收率為96.8%，RSD為0.87%（n=6）。 結(jié)論 本研究建立的薄層色譜法和高效液相色譜法專屬性強，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于扶正化積合劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 扶正化積合劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芪甲苷

[中圖分類號] R284 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（c）-0091-04

扶正化積合劑是山東省日照市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）自行研制用于治療氣虛血瘀、痰濕積聚，癥見疲乏無力、四肢倦怠、精神不振，痰涎壅盛，舌體胖、舌質(zhì)黯或有瘀斑、瘀點，苔厚膩，脈沉弦滑的醫(yī)院制劑，處方由黃芪、炙黃芪、仙鶴草、法半夏、茯苓、三七、雞血藤、淫羊藿、醋鱉甲、砂仁等十味中藥組方而成，具有補氣扶正、活血化瘀、化痰散結(jié)功能，用于晚期肺癌、胃癌、食管癌等見上證者。為了有效控制扶正化積合劑的質(zhì)量，本文參照《中國藥典》2010年版中的有關(guān)鑒別方法，采用薄層色譜法對本制劑中三七[1]11、黃芪[1]283、炙黃芪[1]283、淫羊藿[1]306、進行鑒定分析，筆者參照《中國藥典》2010年版一部黃芪項下黃芪甲苷的含量測定方法及其有關(guān)資料對其中的黃芪甲苷含量進行了測定。結(jié)果顯示本方法專屬性強，簡便易操作，結(jié)果準(zhǔn)確，且重現(xiàn)性好，可用于控制扶正化積合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10ATVP高效液相色譜儀及其工作站（日本島津公司）；精密電子天平（瑞士Sartorius）；HHS21.4電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械三廠）；三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；HS3120超聲波清洗器（天津市蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司）；GZX-9076MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱溫控議（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0781-200311）；黃芪對照藥材（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：120974-200609）；淫羊藿對照藥材（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：120941-200807）；三七對照藥材（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110737-200415）；甲醇、乙腈為色譜純，水為三重蒸餾水，甲酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、硫酸、三氯甲烷、正丁醇、丁酮、氨水、三氯化鋁、氫氧化鈉均為分析純，扶正化積合劑（日照市婦幼保健院制劑室制備，批號：140511、140523、140618、10706），陰性對照品為我院制劑室制備，所用藥材均符合《中國藥典》2010年版一部有關(guān)要求；硅膠G薄層板、硅膠H薄層板（青島勝?；び邢薰荆?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

本制劑的鑒別主要是對君藥（黃芪、炙黃芪）、淫羊藿、三七進行了鑒別。

2.1.1 黃芪的薄層色譜鑒別 取本品10 mL，加乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。另精密稱取黃芪對照藥材1.0 g，并加入乙酸乙酯20 mL，超聲10 min后濾過，濾液濃縮至1 mL左右，將其作為對照藥材溶液。參考《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B項下的薄層色譜法進行試驗：各吸取供試品溶液、對照藥材溶液均為5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇（8.5∶1.5），進行展開，取出并晾干，置NH3蒸氣中熏制，365 nm波長下行紫外光燈檢視。供試品溶液色譜圖片顯示，在與對照藥材溶液色譜的相應(yīng)位置處，呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液色譜顯示其他藥味無干擾。見圖1（封三）。

2.1.2 淫羊藿的薄層色譜鑒別 取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取鑒別項下供試品溶液和淫羊藿對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品色譜顯示其他藥味無干擾。見圖2（封三）。

2.1.3 三七的薄層色譜鑒別 精密量取本品25 mL，加飽和狀態(tài)的正丁醇提取，共計3次，每次30 mL，合并其提取液，用1%NaOH溶液洗滌，共計2次，每次25 mL，濾液蒸干，并加入甲醇約2.5 mL溶解，將其作為供試品溶液備用。另取三七對照藥材1.0 g，加水10 mL，攪勻，加飽和狀態(tài)的正丁醇10 mL，均勻振蕩10 min，放置2 h，離心取上清液，加3倍量的正丁醇飽和水，振蕩均勻，放置并使之分層，取正丁醇層，蒸干，濾液蒸干，并加甲醇約1 mL溶解，將其作為對照藥材溶液。參考《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B項下薄層色譜法進行試驗，分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液均為5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，于低于10℃下以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶50∶25∶10）的下層溶液作為展開劑，進行展開。試驗完畢，取出薄層板并晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰顯現(xiàn)。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)，陰性對照品溶液色譜顯示其他藥味無明顯干擾。見圖3（封三）。

2.2 檢查

按照《中國藥典》2010年版附錄Ⅰ J合劑項下的要求，進行相關(guān)的檢查。

2.2.1相對密度 相對密度的檢查按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅶ A應(yīng)不低于1.02，采用比重瓶法測定。結(jié)果顯示，三批樣品（批號：140511、140523、140618）的相對密度測定結(jié)果分別為1.06、1.03、1.02。根據(jù)三批樣品測定的結(jié)果，暫確定本制劑的相對密度不得低于1.02。

2.2.2 pH值 按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅶ G法測定應(yīng)為4.0～6.0。結(jié)果顯示，三批樣品（批號：140511、140523、140618）的pH測定結(jié)果分別為4.24、4.79、5.24。根據(jù)三批樣品測定的結(jié)果，暫確定本制劑的pH控制在4.0～6.0。

2.2.3 最低裝量檢查 按照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅫC最低裝量檢查法。本制劑為多劑量包裝，每一瓶裝量為200 mL。按規(guī)定的方法檢查，結(jié)果表明裝量均不小于標(biāo)示量的97%。

2.3 黃芪甲苷含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（68∶32）；檢測波長：205 nm；柱溫：40℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；黃芪甲苷的保留時間為：25.971 min。

2.3.2 黃芪甲苷對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品10.51 mg，用甲醇定容至25 mL的容量瓶中，制成濃度為0.4204 mg/mL的對照品溶液備用。

2.3.3 黃芪甲苷供試品溶液的制備 精密量取本品20 mL，用飽和的正丁醇溶液提取，共計3次，每次35 mL，合并濾液，用NH3溶液充分洗滌，共計2次，每次35 mL，棄去NH3溶液，濾液蒸干，并加水約10 mL振搖溶解，室溫放置，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑d=1.5 cm，柱高H=12 cm），洗脫，棄去水液，再加30 mL左右的40%乙醇洗脫，棄去洗脫液，并用80 mL左右的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，放干，加甲醇溶液使之溶解，后移入10 mL的容量瓶中，搖勻，即得，備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，并取同黃芪甲苷對照品溶液10 μL左右分別進樣。以峰面積（Y）對進樣量（X）行線性回歸，結(jié)果回歸方程為：Y=1691.615X+4.154，r=0.9997，線性范圍為：0.2102～4.2040 μg，表明在此范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.3.5 陰性空白試驗 取缺黃芪、炙黃芪的陰性對照品按照扶正化積合劑的方法制備相關(guān)溶液，再參考“2.3.3”項下供試品溶液的方法制備陰性對照品溶液，參考“2.3.1”項下的色譜條件進樣檢測。結(jié)果，在黃芪甲苷對照品相同位置上無干擾峰（圖4），表明處方中其他藥味對黃芪甲苷的測定未形成明顯干擾。

2.3.6 精密度試驗 取對照品溶液，參考“2.3.1”項下色譜條件進樣檢測測定，連續(xù)6次，結(jié)果顯示，對照品溶液中的黃芪甲苷溶液峰面積的RSD為0.85%（n=6），提示其精密度試驗良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品溶液，參考“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，依據(jù)“2.3.1”項下色譜條件進樣 ，分別在0、5、10、15、20、25 h進行測定，結(jié)果顯示，在25 h內(nèi)供試品溶液的黃芪甲苷峰面積的RSD為1.04%（n=6），提示該方法穩(wěn)定性較好。

2.3.8 重復(fù)性試驗 精密量取同一批號的樣品（批號：140511）6份，每份10 mL，參考“2.3.3”項下方法制備供試品溶液。結(jié)果顯示，供試品溶液中黃芪甲苷的平均含量值為0.1417 mg/mL，RSD為0.63%（n=6），提示該方法重復(fù)性較好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液6份（批號：140511，測得含量為0.1417 mg/mL），分別準(zhǔn)確加入黃芪甲苷對照品，搖晃均勻，參考“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，用外標(biāo)法計算含量。結(jié)果顯示，黃芪甲苷的平均回收率為96.8%，RSD為0.87%（n=6）。見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗（n=6）

2.3.10 樣品測定 取4個批號下的扶正化積合劑（批號：140511、140523、140618、140706），參考“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，依據(jù)“2.3.1”項下色譜條件進樣 ，測定其相應(yīng)的峰面積，以外標(biāo)法計算樣品的含量，測定3次，取其平均值。見表2。

表2 樣品測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 試驗方法的選擇

本研究利用薄層定性來鑒別黃芪、淫羊藿、三七，結(jié)果其分離度好，專屬性強。另外，在《中國藥典》2010年版中，黃芪藥材的含量測定方法已經(jīng)采用HPLC法[1][212]，另有資料顯示含黃芪的復(fù)方制劑現(xiàn)多采用HPLC法測定黃芪甲苷的含量[2-8]。本文采用HPLC法對扶正化積合劑中黃芪甲苷進行含量測定，操作簡單，分離度好，靈敏度高。

3.2 試驗波長的選擇

采用高效液相色譜法測定黃芪甲苷的含量，需選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL進行檢測。參考《中國藥典》2010年版一部項下黃芪采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，由于該檢測器普及程度低，不便操作，故筆者參照有關(guān)資料[9]選用紫外檢測器檢測。由于黃芪皂苷種類較多，結(jié)構(gòu)相近，紫外掃描只在200 nm有末端吸收，因此定在200 nm處檢測[10-15]，實驗表明，波長越長，噪聲越小，但靈敏度越低；越靠近200 nm，靈敏度越高，但噪聲越大，綜合考察這兩個因素，本實驗選取205 nm作為檢測波長，測得的黃芪甲苷峰峰形好，取得了滿意的效果。

3.3 試驗流動相的選擇

在選用流動相時，筆者分別使用甲醇-水（68∶32）[16]、乙腈-水（32∶68）[17]、（40∶60）[18]、（35∶65）[19-20]、（1∶2）[21-22]等進行試驗。經(jīng)多次實驗，流動相甲醇-水（68∶32）峰形好，響應(yīng)值大，理論板數(shù)高。流動相乙腈-水（32∶68）峰形好，理論板數(shù)雖然高，但響應(yīng)值略小，其他3種流動相峰形不理想，故筆者以甲醇-水（68∶32）作為流動相，取得了滿意的分離效果和測量效果。

3.4試色譜條件的選擇

對樣品制備時4次正丁醇提取后的水液按“2.3.3”項下方法制備成樣品，按既定色譜條件進行檢測，結(jié)果在黃芪甲苷對照品相同位置處未發(fā)現(xiàn)色譜峰，可見本實驗采用的提取方法提取率高。

綜上所述，本研究建立的薄層色譜法和高效液相色譜法專屬性強，簡便易操作，結(jié)果準(zhǔn)確，且重現(xiàn)性好，可用于扶正化積合劑的質(zhì)量控制。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 宋成英，封加福.HPLC同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（11）：115-117.

[3] 韓亮，余楚欽，林華慶，等.UPLC-DAD技術(shù)快速分析黃芪藥材及制劑中主要黃酮成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：115-118.

[4] 聶穎蘭，范斌，郭娜，等.HPLC-ELSD法測定健脾益腎膠囊中黃芪甲苷的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（17）：130-132.

[5] 張龍.HPLC-ELSD法測定中藥復(fù)方黃芪注射液中黃芪甲苷的含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（12）：318-320.

[6] 孫學(xué)惠，陳宇峰，吳瓊，等.正交試驗優(yōu)選黃芪桂枝五物湯提取工藝研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42（9）：486-488.

[7] 徐小芳.用HPLC法測定復(fù)方附子口服液中黃芪甲苷的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2013，13（5）：380-381.

[8] 孟楣，魏良兵，王芳，等.UPLC-ELSD法測定芪白平肺膠囊中黃芪甲苷[J].中成藥，2013，35（12）：2634-2637.

[9] 原田正敏.日本常用生藥的定量方法[J].國外醫(yī)藥：植物藥分冊，1990，5（5）：201.

[10] 丁水平，馬寶瑕，張銳.黃芪甲苷檢測在黃芪及其制劑控制中的應(yīng)用[J].中國藥師，2001，4（5）：360

[11] 金芳，俞明霞，顧凱，等.黃芪的薄層色譜熒光鑒別[J].中國中藥雜志，2002，27（9）：711-712.

[12] 馮鎖民，陳姍，亢孝弟，等.降糖膠囊薄層鑒別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].應(yīng)用化工，2013，42（11）：2103-2107.

[13] 李育民.香芍顆粒中4味藥材的薄層色譜研究[J].中國藥業(yè)，2013，22（23）：33-35.

[14] 陳瑞杰，張南生.用薄層色譜法測定陽強保腎丸中淫羊藿和補骨脂的含量[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2004，20（3）：222-223.

[15] 李翔，朱臻宇，朱東亮，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測梯度洗脫法測定黃芪藥材中黃芪甲苷的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27（3）：331-333.

[16] 俞家華，曹正中，張勤.膜莢黃芪中黃芪甲苷的含量測定[J].中藥通報，1986，11（9）：38.

[17] 夏愛軍.用HPLC法測定芪歸生脈膠囊中黃芪甲苷的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8（4）：10.

[18] 覃學(xué)謙，陳洪濤，蔡丹昭.HPLC法測定芪脈口服液中黃芪甲苷的含量[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，8（4）：57.

[19] 王寶，蘇健，魯靜.黃芪甲苷的檢測在中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，1996，21（3）：16.

[20] 段亞麗，謝梅冬.黃芪化學(xué)成分及其有效成分黃芪甲苷含量測定的研究現(xiàn)狀[J].中國獸藥雜志，2005，39（3）：35-38.

[21] 胡琨.HPLC測定芪腎口服液中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，30（2）：195-196.

[22] 夏廣萍，劉鵬，韓英梅，等.不同處理方法和不同產(chǎn)地黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定[J].中藥材，2008，31（3）：385-387.

（收稿日期：2014-11-22 本文編輯：衛(wèi) 軻）