趙文博，李瑞航，賀鵬亮，李朋婭，王夢醒，楊春華，于永忠，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

羊口瘡是由羊口瘡病毒引發(fā)的羊?qū)賱游锝佑|性皮膚傳染病，主要侵害2～5月齡羔羊，引起感染部位皮膚以及粘膜增生性病變[1]。臨床上主要以感染動物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部分皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征，在感染羊群中采用抗病毒藥物以及抗生素治療，發(fā)病率依然能達(dá)到60%，死亡率達(dá)到24.7%，并且偶爾感染人的一種人畜共患傳染病[2]。羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，病毒粒子長250～280 nm，寬170～200 nm，呈橢圓形的線團(tuán)樣，且病毒粒子外有囊膜包裹，ORFV基因組長134～139 kb，病毒基因組中間是一個長的中心編碼區(qū)，兩頭是相同的反向末端重復(fù)序列[3]。在ORFV全基因組中，第11號基因?yàn)锽2L基因，位于病毒的保守區(qū)，基因全長1 137 bp，是一個完整的閱讀框，編碼蛋白質(zhì)大小為42 kDa。該蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，并刺激淋巴細(xì)胞釋放[4-5]。然而，目前專門針對這種疾病的藥物相對較少，國內(nèi)外對于ORFV中蛋白質(zhì)的抗原性研究較少，但已經(jīng)肯定的是B2L蛋白是羊口瘡病毒優(yōu)勢抗原之一[6]。因此實(shí)驗(yàn)借助PCR技術(shù)擴(kuò)增B2L基因?qū)⑵涠ㄏ蚩寺≈羛ET-30a，成功構(gòu)建pET30a-B2L表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究羊口瘡病毒，分析鑒定細(xì)胞表位以及基因工程疫苗的制作夯實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊口瘡病毒保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院分子病毒研究室。病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、pET-30a載體、PMD18-T載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ購自Promega公司；DNA Marker DL2000、LA Taq DNA聚合酶、氨芐青霉素購于TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 引物

根據(jù)ORFV標(biāo)準(zhǔn)株NZ2，利用primer5設(shè)計一對引物，F(xiàn)：CCAAAGCTTTACATAATCGGGGTTGCC，R：CCGAATTCTCACACGATGGCCGTGACC，分別帶有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。預(yù)計PCR產(chǎn)物大小為1 137 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增B2L基因

25μLPCR體系中加入模板2μL，dNTPs 2μL，Taq酶 0.5μL，F(xiàn)引物 0.5μL，R引物 0.5μL，10× buffer2.5μL，ddH2O 17μL。PCR反應(yīng)條件是在95℃，5min，95℃，30 s，52℃，30 s，72℃，30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.4 B2 L目的基因克隆

首先，將目的基因連接至T載體，連接體系混勻后瞬時離心，16℃水浴4 h或過夜。之后將連接產(chǎn)物做全量轉(zhuǎn)化。事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。于-70℃冰箱中取出一支100μL的感受態(tài)細(xì)胞，手心融化后立即放入冰盒中，把連接產(chǎn)物全量加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕旋混勻，置冰上放置30 min，然后42℃熱休克90 s，注意不要搖動，立即冰浴5 min，在超凈工作臺中向上述管中加入1 mL事先37℃水浴的LB液體培養(yǎng)基中，然后固定到空氣搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。瞬時放在離心機(jī)上3 000 rpm離心5min，將上清液留約200μL，其余倒掉，旋渦震蕩混勻菌體，將其涂布于含有氨芐抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送至金唯智生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 重組蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建

取序列測定正確的克隆質(zhì)粒用HindⅢ和EcoRⅠ內(nèi)切酶酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET-30a載體在T4連接酶作用下16℃連接4 h，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑單菌落培養(yǎng)，并進(jìn)行質(zhì)粒的提取，HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定和PCR檢測，篩選陽性克隆。取經(jīng)酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

測序結(jié)束后，別將測序正確的50μLpET30a-B2L重組菌接種于含Amp+的50mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值為0.6時，取1 mL菌液于1.5 mLeppendorf管中，12 000 rpm離心1 min，倒掉上清。在剩余49 mL菌液中加入100 mM的誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mM，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)，在 3 h取1mL菌液，12 000 rpm離心1min，倒掉上清，在沉淀中加入90μL1×上樣緩沖液和10μLDTT，吹打混勻，煮沸5min，取10μL進(jìn)行SDS-PAGE。將重組菌按最佳誘導(dǎo)時間培養(yǎng)后，12 000 rpm離心1min，沉淀重懸后超聲波破碎，12 000 rpm再離心5 min，分別取10μL上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定重組菌是否為可溶性表達(dá)。重組蛋白N末端含有6個連續(xù)His殘基，利用能與Ni2+結(jié)合的特性，應(yīng)用MagneHisTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增B2L基因

利用特異性引物，以提取的羊口瘡病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 137 bp處有一個條特異性亮帶與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增B2L基因Fig.1 PCR amplification of B2L gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)6個小時，然后提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行質(zhì)粒PCR，得到的特異條帶與預(yù)期相符（圖2），以及用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，酶切得到的兩個片段一個大約5 400 bp與pET-30a大小相等，另一個片段大約1 137 bp與目的片段大小相符（圖3）。

圖2 pET30a-B2L重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombination plasmid

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombination plasmid by restriction endonuclease digestion

2.3 B2L重組蛋白的表達(dá)與純化

含重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-B2L的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)處理后，在進(jìn)行SDS-PAGE分析。誘導(dǎo)菌分別在約49 kDa處有一大量表達(dá)的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小相符，通過鎳顆粒純化方法獲得比較純凈重組蛋白（圖4）。

圖4 重組B2L蛋白表達(dá)以及純化Fig.4 Expression and purification of recombinant B2L protein

3 討論

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們對肉類食品的需求越來越大，養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)羊業(yè)也隨之蓬勃發(fā)展，羊群數(shù)量大幅增加，飼養(yǎng)密度越來越大，但在養(yǎng)殖過程中，與之相關(guān)的一些疾病也越發(fā)明顯，羊口瘡就是一種常見的疾病，一旦染病，就給養(yǎng)殖戶帶來較大損失[7-10]。羊傳染性膿皰病毒基因組是雙鏈DNA，基因組全長130～150 kb，編碼產(chǎn)生幾十種蛋白。由于該病毒編碼蛋白種類眾多，因此對該病毒編碼蛋白的研究并不十分全面。目前本病在國內(nèi)外普遍存在，特別是我國的黑龍江、新疆、內(nèi)蒙、西藏、青海、吉林等地近年頻頻爆發(fā)。給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。雖然ORFV感染機(jī)體后引起的免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，但是由ORFV011（B2L）基因編碼產(chǎn)生的42 kDa蛋白因其所具有的良好的免疫原性仍然受到世界各國學(xué)者的高度重視[11]。實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)方法，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體并成功表達(dá)，為下一步制作單克隆抗體以及細(xì)胞表位篩選打下堅實(shí)基礎(chǔ)。

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