韓承新,賈元利,黑　硯,蔡曉軍,武金虎

100039　北京，武警總醫(yī)院：1.普通外科，2.眼眶病研究所

大腸癌組織因子與淋巴管形成的關(guān)系

韓承新1,賈元利1,黑硯2,蔡曉軍1,武金虎1

100039北京，武警總醫(yī)院：1.普通外科，2.眼眶病研究所

【摘要】目的探討大腸癌組織中組織因子(tissue factor，TF)和淋巴管形成之間的相關(guān)性。方法收集2011-01至2012-01期間，我院手術(shù)切除的大腸癌病例及相應(yīng)手術(shù)切除的原發(fā)灶石蠟塊，采用免疫組化的方法，觀察TF、podoplanin在腫瘤組織中的表達(dá)以及微淋巴管密度，比較TF陽性和陰性表達(dá)組之間微淋巴管密度的差別。結(jié)果TF陽性表達(dá)組的微淋巴管計(jì)數(shù)(47.23±26.12)明顯高于陰性表達(dá)組(36.77±21.56)。結(jié)論大腸癌腫瘤細(xì)胞組織因子表達(dá)與腫瘤邊緣微淋巴管密度之間高度相關(guān)，提示組織因子可能通過某種機(jī)制促進(jìn)腫瘤淋巴管形成。

【關(guān)鍵詞】大腸癌；組織因子；淋巴管形成

【中國圖書分類號】R735.34

Relationship between TF and lymphangiogenesis in colorectal carcinoma

HAN Chengxin1, JIA Yuanli1，HEI Yan2, CAI Xiaojun1, and WU Jinhu1.1.Department of General Surgery, 2.Department of Ophthalmology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between tissue factor (TF) and lymphangiogenesis in colorectal cancer. MethodsOperation records of resected colorectal cancer and corresponding paraffin block of resected primary tumors from 2011/1/1 to 2012/1/1 in this hospital were collected. By immunohistochemistry, the expression of TF, podoplanin in tumor tissues, and microlymphatic vessel density,were observed,and the microlymphatic vessel density between TF positive and negative expression groups. ResultsThe microlymphatic vessel density in positive TF group(47.23±26.12). was higher than that in negative group(36.77±21.56). ConclusionsThere is high correlation between TF and microlymphatic vessel density in colorectal cancer.

【Key words】colorectal cancer; tissue factor; lymphangiogenesis

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，淋巴途徑轉(zhuǎn)移是其主要的轉(zhuǎn)移方式之一，也是影響預(yù)后的主要因素之一。但是，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制復(fù)雜，直到目前，還有許多影響淋巴道轉(zhuǎn)移的細(xì)節(jié)尚不清楚。淋巴管形成(lymphangiogenesis)是近年來新的腫瘤研究領(lǐng)域，目前發(fā)現(xiàn)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制密切相關(guān)，甚至有人認(rèn)為是淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。Podoplanin作為淋巴管特異性標(biāo)記物，是目前最常用的研究淋巴管形成指標(biāo)之一。組織因子(tissue factor, TF)也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，與大腸癌血運(yùn)和淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，但是在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中的作用環(huán)節(jié)還不清楚，推測，可能是通過淋巴管形成機(jī)制影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但是未見有這方面研究報(bào)道證實(shí)。本研究采用免疫組化的方法，探討大腸癌組織中TF和淋巴管形成之間是否存在相關(guān)性。

1材料與方法

1.1收集病例資料收集2011-01至2012-01，我院手術(shù)切除的大腸癌病例及相應(yīng)手術(shù)切除的原發(fā)灶石蠟塊，登記性別，年齡，腫瘤部位，術(shù)后TNM分期。

1.2主要試劑TF單克隆抗體，podoplanin單克隆抗體，以及相應(yīng)的免疫組化試劑盒。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法將石蠟塊制成切片后，同一病例分別做兩個(gè)指標(biāo)：TF，podoplanin[2，3]。簡述如下：將組織切片用二甲苯脫臘6~10 min，用由高到底的不同濃度乙醇,室溫下連續(xù)稀釋水化組織切片。4 ℃下將切片浸入含有0.3%H2O2甲醇溶液15 min，以封閉內(nèi)源性的過氧化物酶活性。室溫下，用含10%牛血清的PBS液封閉切片1 h，然后用PBS液沖洗切片3次。用TF單克隆抗體或Podoplanin單克隆抗體，4 ℃孵化過夜16 h，實(shí)驗(yàn)液沖洗切片3次，每次5 min。最后DAB法染色。

1.4病理觀察指標(biāo)TF陽性為腫瘤內(nèi)棕色顆粒(圖1)。高倍鏡視野下腫瘤細(xì)胞陽性數(shù)小于10%為陰性。據(jù)此分為TF陽性組和陰性組。Podoplanin染色陽性為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞棕色顆粒(圖2)。反映淋巴管形成的指標(biāo)為微淋巴管密度(microlymphatic vessel density, MLD)，判斷方法見參考文獻(xiàn)[3]。需要觀察腫瘤邊緣3個(gè)視野，取均數(shù)。

圖1　TF陽性表達(dá)(×100)

圖2　podoplanin陽性表達(dá)(×100)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用方差分析，比較各年齡、性別、腫瘤分期、TF表達(dá)與MLD之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

60例平均年齡62歲，中位年齡58歲。性別、腫瘤部位、腫瘤分期、腫瘤組織TF表達(dá)的分布情況見表1。

本組平均MLD為41.56±27.12。各個(gè)參數(shù)的MLD見表1?？梢?，TF陽性組的MLD明顯高于TF陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　60例大腸癌患者臨床資料分布

3討論

大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不完全清楚。隨著腫瘤血管形成(angiogenesis)成為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新的重大領(lǐng)域后，最近，開始關(guān)注淋巴管形成對腫瘤轉(zhuǎn)移的意義。淋巴管形成是指毛細(xì)淋巴管從已有的淋巴管發(fā)芽生長，形成毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)[1]，而MLD是反映淋巴管形成的形態(tài)學(xué)研究指標(biāo)。研究顯示，腫瘤中的淋巴管形成與腫瘤的復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后明顯相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，導(dǎo)入VEGF-C和VEGF-D的腫瘤細(xì)胞，植入動(dòng)物體內(nèi)后，可以誘發(fā)腫瘤內(nèi)部或邊緣淋巴管形成，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4，5]。目前認(rèn)為，淋巴管形成與淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系可能有以下方面：通過增加淋巴管的密度，增加腫瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸機(jī)會(huì);新生的淋巴管表現(xiàn)出有利于轉(zhuǎn)移的分子表型，提高腫瘤細(xì)胞附著機(jī)會(huì)；腫瘤細(xì)胞分泌生長因子促進(jìn)腫瘤生長。

大腸癌的淋巴管形成具有異質(zhì)性，表現(xiàn)為新生淋巴管主要位于腫瘤邊緣區(qū)，而腫瘤內(nèi)部幾乎沒有[4]。因此，為了提高淋巴管的檢出率和可比性，本組淋巴管計(jì)數(shù)統(tǒng)一采用的視野位于腫瘤邊緣。

podoplanin是一種整合胞質(zhì)胞膜黏蛋白，主要表達(dá)在小淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。有些血管內(nèi)皮細(xì)胞也有它的表達(dá)，但僅限于皮膚某些血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此，該蛋白是目前較理想的淋巴管標(biāo)志物。本研究顯示，該指標(biāo)顯示效果滿意，可以用于腫瘤淋巴管形成的研究。

TF又稱凝血因子Ⅲ或組織凝血活酶(tissue thromboplastin)。在凝血過程中起著啟動(dòng)子的作用。它是凝血因子中唯一在細(xì)胞表面表達(dá)的Ⅰ型跨膜糖蛋白。相對分子質(zhì)量約為47 ku,分為細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域、細(xì)胞內(nèi)區(qū)域等3個(gè)部分。TF不僅是因子Ⅶ和Ⅶa的受體,而且是Ⅶa催化活性的絕對必需的輔因子。TF與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，作用機(jī)制主要是通過促進(jìn)腫瘤血管形成，影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程。

本研究結(jié)果顯示，組織因子表達(dá)陽性的大腸癌，腫瘤周邊的淋巴管形成明顯增多，高于組織因子表達(dá)陰性的大腸癌患者。提示組織因子表達(dá)與淋巴管形成有關(guān)系。以往有研究顯示，TF表達(dá)陽性的大腸癌患者，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)高[6]。結(jié)合本研究結(jié)果，可能和TF促進(jìn)腫瘤淋巴管形成有重要關(guān)系。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的強(qiáng)烈刺激劑。研究表明，VEGF-C和VEGF-D是目前發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成的主要因子，被稱為淋巴管生長因子， 它通過與VEGFR-3結(jié)合，使其活化，然后通過MAPK信號途徑，使淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活，形成新生淋巴管。TF通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)或蛋白激酶C(PKC)途徑信號傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤及其周圍基質(zhì)細(xì)胞VEGF轉(zhuǎn)錄的增加[7]。另外，VEGF也能通過誘導(dǎo)蛋白水解酶增加TF的產(chǎn)生。所以，TF可能是通過影響VEGF間接影響淋巴管的形成過程。

性別和腫瘤部位與淋巴管形成沒有明顯關(guān)系，這與臨床觀察結(jié)果符合，說明大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移與性別、腫瘤原發(fā)部位無關(guān)。

TNM分期是基于腫瘤的原發(fā)灶侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移位置和數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而制定的。但是，本研究結(jié)果顯示，TNM分期與淋巴管形成沒有明顯關(guān)系。提示，淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目可能沒有線性關(guān)系。另外，也可能和本組病例數(shù)目較少有關(guān)，今后需要進(jìn)一步加大病例數(shù)量，觀察淋巴管形成和TNM分期的關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

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(2014-06-03收稿2015-07-21修回)

(責(zé)任編輯張楠)

作者簡介：韓承新，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:hcxhyfhq@sina.com

基金項(xiàng)目：武警總部三類課題(WJ2006024)