林華剛，王　博，張　軍，賈紅蔚

1.100037，武警北京總隊第二醫(yī)院外二科；2.300052，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內分泌科

胰島素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠骨轉換和骨力學性能的影響

林華剛1，王博1，張軍1，賈紅蔚2

1.100037，武警北京總隊第二醫(yī)院外二科；2.300052，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內分泌科

【摘要】目的探討胰島素對于鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠骨量、骨轉換狀態(tài)和骨力學性能的影響。方法單次尾靜脈注射STZ制造糖尿病大鼠模型，成模后分為糖尿病大鼠組(DM)、胰島素治療組(INS)與正常對照組(CON)，8周后處死，測定3組大鼠血清骨鈣素和尿Ⅰ型膠原氨基末端交聯(lián)肽(NTx)/肌酐(Cr)比值，DEXA方法測定大鼠離體腰椎和股骨骨密度。骨形態(tài)計量學方法分析大鼠骨量和骨轉換變化情況。采用股骨三點彎曲試驗和腰椎壓縮試驗分析各組大鼠骨力學性能。結果與CON組相比，DM大鼠血清骨鈣素和尿NTx/Cr比值降低，DM大鼠腰椎和股骨骨密度降低。與DM組大鼠相比，INS組大鼠血清骨鈣素水平增高，尿NTx/Cr比值無變化，INS組大鼠腰椎和股骨骨密度顯著增大(P<0.01)，但未達CON組水平。骨形態(tài)計量學分析提示與CON組相比，DM大鼠骨小梁骨量[TBV/TTV(12.06±2.48)% vs (24.12±1.84)%, P<0.01]減少，骨形成速率減低[(0.44±0.11) vs (0.78±0.14)μm/d, P<0.01]。與DM組大鼠相比，INS組大鼠骨小梁骨量顯著增加[TBV/TTV(19.75±2.43) %, P<0.01]，骨形成速率亦增加[(0.70±0.16) μm/d, P<0.01]。股骨三點彎曲試驗顯示，與CON組大鼠相比，DM組大鼠最大載荷、彈性載荷、彎曲能量、最大應力均顯著減低(P<0.01)。與DM組相比，INS組上述各力學指標均顯著增加(P<0.01),但均未達CON組水平。椎體壓縮實驗提示與CON組大鼠相比，DM組大鼠最大載荷、彈性載荷、能量吸收、彈性模量均顯著減低(P<0.01)。與DM組相比，INS組上述各指標亦顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論DM大鼠表現(xiàn)為低轉換型骨量減少，且骨力學性能下降，胰島素治療可以促進骨形成，增加骨量，且能改善DM大鼠的骨力學性能。

【關鍵詞】糖尿病；胰島素；骨密度；骨形態(tài)計量學；骨生物力學測試

【中國圖書分類號】R589.5

Effects of insulin on diabetic bone histomorphometric and biomechanical abilities in streptozotocin-treated rats

LIN Huagang1, WANG Bo1, ZHANG Jun1, and JIA Hongwei2.1.Department of Orthopedics, the Second Hospital of Beijing Municipal Corps of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100037,China; 2.Department of Endocrinology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of insulin on bone mass and the condition of bone turnover and bone biomechanical properties in STZ-induced diabetic rats. MethodsOf 45 male SD rats studied, 30 were made diabetic by intravenous injection of streptozocin(50 mg/kg) on day -7. Thirty diabetic rats were randomly divided into 2 groups as group DM and control group. DM group were injected subcutaneously with insulin (6 U/kg/d) regularly.After their sacrifice on the day 56, blood was sampled and serum was separated for the measurement of Ca, P, ALPand OC. The left tibia was dissected for bone histomorphometry analysis. Right femur and lumbar vertebrae(L1-L4) were reserved for BMD test. The left femor was separated for three-point bending test,while the fifth lumbar vertibra was prepared for compression test to reflect the biomechanical properties of bone.ResultsA low-turnover osteopenia was evidenced in diabetic rats by decreased BMD in both femur and lumbar vertebrae, reduced serum OC level, decreased urine NTx/Cr ratio, decreased trabecular volume[TBV/TTV(12.06±2.48)vs(24.12±1.84)%,P<0.01]and bone formation rate[(0.44±0.11) vs (0.78±0.14)μm/d,P<0.01] by bone dynamic study. All these abnormalities except urine NTx/Cr ratio were partly or completely normalized by insulin treatment. The bone densities in vertebrae and femur of diabetic rats significantly decreased(P<0.01). Maximal load, elastic load, bending energy, maximal stress in three-point bending test were conducted,compared with normal control rats. These abnormalities could be partially corrected by insulin teatment(P<0.01).In addition,the fifth lumbar vertibrae of diabetic rats were obviously decreased(P<0.01), and maximal load,elastic load，energy absorbability and elastic modulus during compressing test. By insulin treatment, these indices partially reversed to the normal control level(P<0.01). ConclusionA low-turnover osteopenia is evidenced in STZ-induced diabetic rats with impaired bone biomechanical abilities.All these abnormalities of bone can be partially corrected by the injection of insulin. It shows that insulin can stimulate bone formation dramatically while not influence osteoclastic activity in diabetic rats.

【Key words】diabetic mellitus; insulin; bone mineral density; bone histomorphemetry; bone biomechanical test

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是以胰島素缺乏、血糖水平升高為特征的一種慢性疾病。其重要的慢性并發(fā)癥就是DM性骨丟失，可引起骨折發(fā)生率增高和骨折愈合延遲[1]。有研究表明，DM骨丟失用胰島素治療后可部分糾正[2]。關于胰島素在改善骨量的同時，能否改善骨的力學性能目前研究有分歧[3，4]。本研究對此問題進一步探究。

1材料與方法

1.1動物與器械SD大鼠(清潔級，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma 公司)，大鼠血清骨鈣素放射免疫測定試劑盒(北京北方生物技術研究所)，大鼠尿Ⅰ型膠原氨基末端交聯(lián)肽(Cross-linked N-telopeptide of TypeⅠcollagen，NTx)酶聯(lián)免疫測定試劑盒(美國ADL公司)，微量血糖儀(羅氏診斷有限公司)，雙能X線骨密度儀(PRODIGY型，美國Lunar公司)，骨切片機(德國POLYCUT)，ELF 3200 力學實驗機：美國BOSE公司。

1.2方法

1.2.1動物分組和取材取體重約為250 g的2月齡SD雄性大鼠45只，隨機分為正常對照(CON)組、糖尿病(DM)組和糖尿病胰島素治療(DMI)組，后兩組按50 mg/kg體重一次性尾靜脈注射STZ造模。給藥72 h后和1周后測定大鼠尾尖隨機血糖，兩次血糖均大于16 mmol/L為造模成功。3組大鼠同步飼養(yǎng)，12 h光照交替，自由攝入相同的去離子水和固體飼料，根據(jù)飼料中鈣和維生素D3含量，以及每日的攝食量估算，每只大鼠每日約攝入鈣50 mg，維生素D31.25 U。成模后8周處死。處死前留取 24 h尿，記錄尿量，-40 ℃冰箱保存，以備測定24 h尿鈣。ELISA測定尿NTx濃度，同時測定尿肌酐(Cr)濃度，計算NTx/Cr比值。股動脈放血處死動物，留取血標本以備測定血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素(OC)水平。分離左側脛骨近端2/3，行骨形態(tài)計量學分析。分離右側股骨和椎骨(L1～5)，用生理鹽水浸透紗布包裹，-20 ℃保存，備做骨密度測量和骨生物力學試驗。

1.2.2四環(huán)素雙標記法在處死動物前14 d和3 d分別進行兩次四環(huán)素標記，采用鹽酸四環(huán)素，每日100 mg/kg體重，分上下午兩次灌胃。

1.2.3骨密度測定將股骨和椎骨(L1～5)沿長軸放在一個小動物平臺上。骨密度儀配備小動物測量軟件，測定質控體模的變異系數(shù)為0.09%。

1.2.4骨形態(tài)計量學分析制備大鼠不脫鈣骨切片，骨切片機切成20 μm厚的切片，光學樹脂封片。于OLYMPUS光學顯微鏡和熒光顯微鏡下，用KONTRON IBA2.0全自動圖像處理系統(tǒng)測量自骺板線遠端1～5 mm范圍內骨組織形態(tài)計量學參數(shù)。(1)骨形態(tài)學參數(shù)。TBV/TTV(%)：骨小梁體積(TBV)占全部骨組織體積(TTV)的百分比。MTPT(μm):平均骨小梁板厚度。MTPS (μm): 平均骨小梁板間隙。Tb.N (個/視野): 平均骨小梁接點數(shù)。MCW(μm): 平均骨皮質寬度。(2)骨動力學參數(shù)。sL.S/TBS(%): 四環(huán)素單標表面。dL.S/TBS(%): 四環(huán)素雙標表面。MS/TBS(%): 骨礦化表面，四環(huán)素單標表面的1/2與雙標表面之和占骨小梁表面的百分比。DDL (μm): 四環(huán)素雙標記線間的平均距離。TOS (%):類骨質表面占全部骨小粱表面的百分比。MOSW (μm): 平均類骨質寬度。MAR(μm/d) 礦化沉積率，用兩條四環(huán)素標記之間的平均距離除以兩次給藥間隔天數(shù)，即每天礦化了多少類骨質MAR=(DDL×π/4)/11。 MLT (d)： 礦化延遲時間：MLT=MOSW/MAR。 Svf(μm /d)：組織水平的骨形成速率，Svf=MAR×MS/TBS。

1.2.5骨生物力學測試

1.2.5.1股骨三點彎曲試驗測試過程是將股骨標本緩慢解凍,保持其濕度,自由放置在支架上，曲面向下，使股骨中點、兩支點中心與加載點重合，勻速加載至標本斷裂，描記出載荷-變形(撓度)曲線。測試溫度23 ℃，實驗機載荷測量精度0.01 N，位移(撓度)測量精度0.001 mm，支座跨距20 mm，壓頭直徑近似為1.5 mm，加載速度5 mm/min，選用200 N以內的小載荷量程。用游標卡尺測量斷骨內徑和壁厚，記錄并分析實驗數(shù)據(jù)。測試指標包括結構力學指標：最大載荷(N)、彈性載荷(N)、彎曲能量(N·mm)。材料力學指標：最大彎曲應力(N/mm2)、彎曲彈性模量(Mpa)。

1.2.5.2椎體壓縮試驗將椎體上下端磨平，修整為高度4～6 mm，具有兩個平行平面的類圓柱體。用螺旋測微儀測量椎體的高度，顯微鏡下計算椎骨橫截面積。將濕潤的腰椎標本置于試驗機上，加載速度為2 mm/min，記錄實驗數(shù)據(jù)，繪制載荷-變形曲線，其他測試條件同股骨三點彎曲實驗。測試指標包括最大載荷(N)、彈性載荷(N)、彈性模量(Mpa)、能量吸收(N.mm)。

2結果

2.1大鼠體重和血糖8周時，DM組體重低于CON組(P<0.01)，血糖高于CON組(P<0.01)。8周時，DMI組體重低于CON組(P<0.01)，與DM組相比無統(tǒng)計學差異，DMI組血糖低于DM組(P<0.01)，但未達正常對照組水平(表1)。

表1　各組大鼠體重和血糖比較　(n=15；

注：與CON組相比，①P<0.01；與DM組相比，②P<0.01

2.2血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素和24 h尿鈣、尿NTx/Cr比較3組大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶相比無統(tǒng)計學差異。與CON組相比，DM大鼠血清骨鈣素水平和尿NTx/Cr均明顯減低(P<0.01)。與DM組相比，DMI 組血清骨鈣素水平明顯升高(P<0.01)，但未達CON組水平。與DM組相比，DMI 組尿NTx/Cr無統(tǒng)計學差異(表2)。

表2　各組大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素和24 h尿鈣、尿NTx/Cr比較　(n=15；

注：NTx：Ⅰ型膠原氨基末端交聯(lián)肽; 與CON組相比，①P<0.01；與DM組相比，②P<0.01

2.3骨密度比較DM組大鼠腰椎骨密度均值(0.107±011)g/cm3，低于CON組(0.149±0.009) g/cm3，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。DM組大鼠股骨骨密度均值(0.099±0.013)g/cm3，顯著低于CON組(0.139±0.013) g/cm3(P<0.01)。DMI組大鼠腰椎骨密度均值(0.118±0.110)g/cm3，股骨骨密度均值(0.116±0.018)g/cm3，均顯著高于DM組，但未達CON組水平。

2.4骨形態(tài)計量學參數(shù)比較DM組大鼠TBV/TTV、MTPT、Tb.N 較CON組顯著減低(P<0.01)，DM組大鼠MTPS 較CON組顯著增加(P<0.01)。DMI組大鼠TBV/TTV、MTPT、Tb.N 較DM組顯著增加(P<0.01)，DMI組大鼠MTPS 較DM組顯著減低(P<0.01)，但未達CON組水平。3組大鼠MCW相比，差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

動力學參數(shù)比較顯示，DM大鼠單標表面、雙標表面、骨礦化表面、類骨質表面、 Svf較CON組顯著減低(P<0.01)，DMI組上述指標較DM組顯著增加(P<0.01)，且可達CON組水平。3組大鼠DDL、MOSW、 MAR、 MLT相比較，無統(tǒng)計學差異(表4)。

表3　三組大鼠脛骨干骺端形態(tài)學參數(shù)比較　(n=15；±s)

注：與CON組相比，①P<0.01；與DM組相比，②P<0.01

表4　三組大鼠脛骨干骺端動力學參數(shù)比較　(n=15；±s)

注：與CON組相比，①P<0.01；與DM組相比，②P<0.01

2.5骨生物力學測試結果股骨三點彎曲試驗表明，與CON組相比，DM 組最大載荷、彈性載荷、彎曲能量、最大應力均顯著下降(P<0.01)。與DM組相比，INS組上述各指標均顯著增加(P<0.01)，但均未達到正常對照組水平(表5)。

腰椎壓縮實驗表明，與CON組相比，DM 組最大載荷、彈性載荷、能量吸收、彈性模量均顯著下降(P<0.01)。與DM組相比，INS組上述各指標均顯著增加(P<0.01)，但均未達到正常對照組水平(表6)。

表5　三組大鼠股骨三點彎曲試驗力學指標比較　(n=15；±s)

注：與CON組相比，①P<0.01；與DM組相比，②P<0.01

表6　各組大鼠腰椎(L5)力學指標比較　(n=15；

注：與CON組相比，①P<0.01；與DM相比，②P<0.01

3討論

本研究采用單次尾靜脈注射STZ 50 mg/kg體重的方法制造糖尿病模型。正常對照組、糖尿病大鼠、胰島素治療的糖尿病大鼠3組血鈣磷水平無顯著性差異。DM組大鼠尿鈣顯著增加，與文獻[5]研究一致。

既往研究顯示，糖尿病患者骨密度減低[6],而高血糖可抑制成骨細胞分化和增殖[7]。新近研究認為，糖尿病骨質疏松的發(fā)生與炎性反應因子密切相關，腫瘤壞死因子α、IL-6有促進骨吸收的作用，與骨密度呈負相關[8]。

本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)，STZ誘導的DM大鼠血清中標志骨形成的OC水平較正常對照組顯著減低51%，同時骨吸收的標志物尿NTx較正常對照組也顯著減低，提示DM大鼠骨形成和骨吸收速率均有下降，為低轉換型骨質疏松。胰島素干預DM大鼠后血清OC水平較單純DM組顯著增加36%，但未達到正常對照組水平。胰島素干預后尿NTx水平較DM組無顯著變化，提示胰島素可能主要通過促進骨形成增加糖尿病大鼠骨量。

骨密度和骨形態(tài)學參數(shù)表明，DM大鼠股骨和腰椎骨密度骨小梁骨量減低，而骨皮質寬度無顯著差異。同時發(fā)現(xiàn)胰島素組大鼠股骨骨密度較單純DM組增加約17%，腰椎骨密度較單純DM組增加約9%，但均未達到正常對照組水平。胰島素治療組骨小梁骨量較單純DM組顯著增加64%，但仍未達正常對照水平。本研究中胰島素治療組血糖雖顯著低于糖尿病組，但仍高于正常對照組。若糖尿病大鼠骨丟失與高血糖相關，那么胰島素治療組骨小梁骨量未達到正常對照組水平，可能與胰島素組血糖未能降到正常對照組水平有關。

骨動力學參數(shù)表明，STZ誘導的DM大鼠骨表面激活率較正常對照組減低，組織水平的骨形成速率和類骨質表面較正常對照組減少，提示STZ誘導的DM大鼠骨形成速度減低造成骨量減少。而胰島素治療組大鼠類骨質表面、骨表面激活頻率、組織水平的骨形成速率均較DM組加快，且與正常對照組相比，胰島素組上述各指標均無顯著性差異，提示胰島素通過促進骨形成增加骨量。這與上述血清骨鈣素的研究結果相一致。

胰島素可直接作用于成骨細胞 ，還可刺激成骨細胞樣細胞增殖，增加胎鼠顱骨的al-前膠原mRNA的表達，促進膠原合成[9]。胰島素促進骨形成的作用可解釋本實驗中胰島素治療組血清OC水平增加，股骨和腰椎骨密度增加，骨形態(tài)學參數(shù)示骨小梁骨量增加，動力學參數(shù)顯示骨表面激活頻率增加，類骨質表面增加，由此計算的組織水平的骨形成速率增加。胰島素對骨吸收是否有作用，尚需進一步研究。本文的研究結果是STZ誘導的糖尿病大鼠8周時骨形成和骨吸收均減慢，胰島素治療促進骨形成，但對骨吸收作用不著。

鑒于骨量和骨強度的變化有時不一致，胰島素雖可以增加骨量，但是否可改善骨力學性能，減少骨折發(fā)生才是臨床工作中更為關注的。有研究證明，對于糖尿病大鼠骨折模型，局部微環(huán)境中應用胰島素，在不影響血糖的情況下，胰島素可直接促進骨折愈合[3]。但也有研究表明，胰島素治療不能改善骨愈合能力[4]。

本研究采用力學實驗驗證了此問題。股骨三點彎曲實驗表明，糖尿病組大鼠最大載荷、彈性載荷、彎曲能量、最大應力較正常對照組均顯著下降，經(jīng)胰島素干預后，上述指標顯著改善，但未達正常對照組水平。腰椎壓縮實驗亦表明，DM 組最大載荷、彈性載荷、能量吸收、彈性模量與正常對照組相比亦顯著下降，胰島素干預后顯著改善，但未能達到正常對照組水平。

可以看出，糖尿病大鼠在糖尿病8周時(相當于糖尿病中晚期)骨量減少是一種低轉換型骨丟失，以骨形成減慢為主，骨吸收無變化。

本研究在糖尿病初發(fā)時即給予胰島素皮下注射治療，除有效降低血糖外，還可通過促進骨形成增加骨量，提示臨床早期應用胰島素可以預防糖尿病相關骨丟失，且可以改善骨力學性能，增加骨抗壓、抗彎、抗骨折的能力，有很大臨床應用價值。

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(2015-03-03收稿2015-04-15修回)

(責任編輯梁秋野)

作者簡介：林華剛，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:lhg13910093279@126.com通訊作者：賈紅蔚，E-mail:jhw19741011@sina.com