馬小強(qiáng)，霍生東

（1.通渭縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，甘肅 通渭743300；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院）

苦杏仁為薔薇科植物山杏（學(xué)名：PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim）的干燥成熟種子。夏季采收成熟果實(shí)，除去果肉及核殼，取出種子，曬干，具有降氣止咳平喘，潤(rùn)腸通便的功效。用于咳嗽氣喘，胸滿痰多，血虛津枯，腸燥便秘，其主要成分為苦杏仁苷。熟地為玄參科植物地黃（學(xué)名：Rehmannia glutinosa）的塊根，又名熟地黃或伏地，經(jīng)加工炮制而成。通常經(jīng)反復(fù)蒸曬，至內(nèi)外色黑油潤(rùn)，質(zhì)地柔軟粘膩，呈不規(guī)則的塊狀、碎塊，大小、厚薄不一。表面烏黑色，有光澤，黏性大。質(zhì)柔軟而帶韌性，不易折斷，有光澤。無臭，味甜。熟地中的毛蕊花糖苷對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用，對(duì)老年癡呆有一定效果。葛（學(xué)名：Pueraria lobata）是豆科葛屬的植物，其根部為中草藥葛根（中藥拉丁名Puerariae Radix），又名鹿藿、黃斤、雞齊根，主治傷寒溫?zé)?、頭痛項(xiàng)強(qiáng)（頸僵）、煩熱消渴、泄瀉、痢疾、麻疹不透、高血壓、心紋痛、耳聾等，有效成分主要是葛根素。何首烏（學(xué)名：Polygoni multiflori），又名野苗、交藤、交莖、夜合、地精、桃柳藤、赤葛、九真藤、芮草、蛇草、陳知白、馬肝石、九真藤、瘡帚等，為蓼科多年生纏繞藤本植物。根細(xì)長(zhǎng)，末端成肥大的塊根，外表紅褐色至暗褐色。何首烏中含2，3，5，4＇－四羥基二苯 乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷養(yǎng)心安神，祛風(fēng)通絡(luò)，補(bǔ)益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎。高效液相色譜法（HPLC）和其他分離方法相比具有柱效高、靈敏度高、分離速度快、適用范圍廣、重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，在中藥化學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，并為中藥分析研究工作提供了條件。在含量測(cè)定方面，幾乎各種結(jié)構(gòu)類型的中藥活性成分均有使用高效液相色譜測(cè)定含量的報(bào)道，許多用薄層色譜不能分離的化合物，而用高效液相色譜卻得到了很好的分離。本研究利用HPLC，對(duì)苦杏仁、熟地黃、葛根和何首烏等4 種中藥的有效成分進(jìn)行檢測(cè)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

LC－10AT 型島津高效液相色譜儀（日本島津公司），苦杏仁產(chǎn)地甘肅、熟地黃產(chǎn)地河南、葛根產(chǎn)地陜西、何首烏產(chǎn)地陜西，乙腈為色譜專用，甲醛色譜專用，水為超純水。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

1.2.1 苦杏仁 取苦杏仁苷對(duì)照品43μg，精密稱定，加甲醇制成每1mL含43μg的溶液，即得。

1.2.2 熟地黃 取毛蕊花糖苷對(duì)照品0.96μg，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1mL 含0.96μg的溶液，即得。

1.2.3 葛根 取葛根素對(duì)照品82μg，精密稱定，加30%乙醇制成每1mL中含82μg的溶液，即得。

1.2.4 何首烏 精密稱取2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品0.218 mg，加稀乙醇制成每1mL含0.218mg的溶液，即得。

1.3 供試品溶液的制備

1.3.1 苦杏仁 稱得本品粉末（過二號(hào)篩）0.2 545 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50kHz）30min；放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 熟地黃 稱得本品最粗粉約2.1 770g，置圓底燒瓶中，加入甲醇100mL，稱定重量，加熱回流30min；放冷后再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50mL，減壓回收溶劑近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 葛根 稱得本品粉末（過三號(hào)篩）約0.1 323 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min；放冷后再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 何首烏 取本品粉末（過四號(hào)篩）0.2g，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，稱定重量，加熱回流30min；放冷后再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液適量，以溶劑為空白，于紫外可見分光光度計(jì)上，在190～600 nm 波長(zhǎng)處掃描最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果可見，苦杏仁苷對(duì)照品溶液在207nm 處有最大吸收，供試品溶液在210nm 處有最大吸收，參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，以207nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)；毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液在334nm 處有最大吸收，供試品在334nm 處有最大吸收，參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，以334nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)；葛根素對(duì)照品在250nm 處有最大吸收，供試品溶液在252nm 處有最大吸收，參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，以250nm 為測(cè)定波長(zhǎng)；2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品溶液在320nm 處有最大吸收，供試品溶液在320nm 處有最大吸收，參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，以320nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，苦杏仁以乙腈－0.1%磷酸溶液（8：92）為流動(dòng)相，波長(zhǎng)207 nm，理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000；熟地黃以乙腈－0.1%醋酸溶液（16：84）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為334nm，理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000；葛根以甲醇－水（25：75）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000；何首烏以乙腈－水（25：75）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm，理論板數(shù)按2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－0－β－D－葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

精密吸取各對(duì)照品溶液（0.208 mg／mL）2、5、8、10、12、15、20μL，注入液相色譜儀，按前述色譜條件記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？嘈尤受栈貧w方程為Y＝479 182 X＋7 188.8，r ＝0.9 999，表明苦杏仁苷在0.416～3.12μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；毛蕊花糖苷回歸方程為Y＝2.01×106X＋1.94×104，r＝0.9 996，線性范圍0.0 542μg～0.542μg；葛根素在7.7μg～123.2μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y＝0.0 336 ＋7.9 466 X，r ＝0.9 998；2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－0－β－D－葡萄糖苷回歸方程Y＝6 109.3 X ＋0.8 212，r＝0.9 999，在0.372×10－3μg～22.320×10－3μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 精密度

精密吸取苦杏仁苷、毛蕊花糖苷、葛根素、2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀中，各連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積積分值為測(cè)定指標(biāo)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，各對(duì)照品RSD 值分別為0.707%、0.57%、0.4%、0.50%，符合要求，方法、儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性

精密吸取各供試品及對(duì)應(yīng)的對(duì)照品各10μL，分別于0、2、6、10、15、24h注入高效液相色譜儀，以峰面積積分值為測(cè)定指標(biāo)，測(cè)定穩(wěn)定性，苦杏仁苷對(duì)照品RSD 為1.68%，供試品RSD 為2.01%，說明在24h內(nèi)穩(wěn)定性都較好；毛蕊花糖苷對(duì)照品RSD為0.64%，供試品RSD 為1.62%，說明在24h 內(nèi)穩(wěn)定性也較好；葛根素對(duì)照品RSD 為1.38%，供試品RSD 為0.17%，說明在24h內(nèi)它們穩(wěn)定性較好；2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品RSD 為1.24%，供試品RSD 為1.08%，說明在24h內(nèi)穩(wěn)定性都較好。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地的苦杏仁、熟地黃、葛根、何首烏各5份，按供試品溶液項(xiàng)下制備方法制備，依法測(cè)定，以有效成分峰面積為測(cè)定指標(biāo)，計(jì)算樣品含量，苦杏仁苷RSD ＝1.939%，毛蕊花糖苷RSD＝1.3%，葛根素RSD＝1.15%，2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷RSD＝0.99%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量（9.077mg／g）的苦杏仁樣品6份，每份約0.22g，置具塞錐形瓶中，再分別加入苦杏仁苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作。其平均回收率為97.25%，RSD 為1.06%。取6份同一批地黃，每份約1g，加入毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液10mL（54.2mg／L），按上述供試品制備方法處理，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，毛蕊花糖苷對(duì)照品平均回收率為97.9%，RSD 為2.39%。精密稱取已知含量的葛根樣品5份，每份約3.50g，加入對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法處理，平均回收率達(dá)到96.7%，RSD 為3.01%。取已知含量的樣品，分別加入二苯乙烯苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按樣品制備方法制得樣品溶液，表明2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D 葡萄糖苷的平均回收率為97.39%，RSD 為1.25%，可見回收率較好，此方法測(cè)定這四種中藥材可行。

2.6 中藥中有效成分的含量測(cè)定

精密稱取苦杏仁0.2 545g，熟地黃2.1 770g，葛根0.1 323g，何首烏0.200g，按1.3供試品溶液的制備操作，按1.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性測(cè)定。計(jì)算含量見表1。

表1 苦杏仁、熟地黃、葛根、何首烏有效含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

苦杏仁、熟地黃、葛根、何首烏在我國(guó)分布廣泛，本研究主要測(cè)定這幾種中藥材中的有效成分，但由于受生長(zhǎng)環(huán)境、栽培條件、采收時(shí)間和加工的影響，其有效成分有一定差異?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010年版要求，苦杏仁含苦杏仁苷不得少于3.0%，熟地黃含毛蕊花糖苷不得少于0.020%，葛根含葛根素不得少于2.4%，何首烏含2，3，5，4＇－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷不得少于1.0%，本批次中藥材均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

中藥有效成分的提取及測(cè)定方法很多，許寧俠研究了苦杏仁中苦杏仁苷不同的提取及檢測(cè)方法，苦杏仁苷的提取有水提法和乙醇提取法，化學(xué)發(fā)光法分析技術(shù)、電化學(xué)分析方法等屬于間接法，其原理是通過水解或酶解把苦杏仁苷分解為苯甲醛、氫氰酸和葡萄糖，然后再測(cè)定相應(yīng)分解物的含量，間接分析苦杏仁苷，適合微量檢測(cè)。薄層掃描法屬于直接法，是一種簡(jiǎn)捷快速的分析方法，靈敏度較高，可直接測(cè)定植物種子中的苦杏仁苷含量。本研究采用高效液相色譜法分離效率高，分析速度快，高效液相色譜法現(xiàn)已成為有機(jī)物定性定量分析研究的主要方法。熟地黃中多糖的提取方法也是多種多樣，許春鵑等研究了用水提醇沉法、酶解提取法、超聲提取法、超濾分離法、微波提取法等，表明水提醇沉法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，但乙醇消耗量大；酶解提取法條件溫和、簡(jiǎn)便、得率高，但酶的價(jià)格昂貴；超聲波提取操快捷、提取時(shí)間短，缺點(diǎn)是超聲波可能會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)影響生物活性；超濾法工藝簡(jiǎn)單，但必須事先知道所要分離的物的相對(duì)分子量，才能有效選擇超濾所用截留值的大?。晃⒉訜岱ㄈ秉c(diǎn)是微波反應(yīng)器的容量有限，難以大規(guī)模提取。范樹國(guó)等對(duì)葛根提取有效成分提取試用了冷浸法、超聲法、超聲與冷浸結(jié)合使用法，超聲提取20min的方法提取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，適合微量檢測(cè)。而只用冷浸提取48h的方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)提取容器的損害較小，用于大規(guī)模提取是一種較好的方法。超聲＋冷浸法使用法顯著優(yōu)于單一提取方法。周麗等研究了亞臨界水提取葛根有效成分，具有省時(shí)、高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型方法。關(guān)于何首烏有效成分的提取，盧照凱等研究的新工藝大大提高了提取純度，主要是采用雙組分纖維素酶前處理及滲漉提取，樹脂柱層析及滲透濃縮和組合鹽助析工藝。蔡麗芬等對(duì)不同產(chǎn)地的何首烏也進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分含量存在著明顯差異，對(duì)何首烏培養(yǎng)也提了一定建議。正規(guī)藥廠對(duì)一批次的中藥材都必須進(jìn)行有效成分的檢測(cè)，對(duì)于同一批不是同一產(chǎn)地的中藥材也進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于不達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的給予退回，可見中藥材有效成分含量檢測(cè)非常重要。本研究利用HPLC測(cè)定苦杏仁、熟地黃、葛根、何首烏中有效成分含量，表明該方法精密度高，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，大大節(jié)省了各成分的測(cè)定時(shí)間及成本。

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