劉 鵬，黃美松，胡陽黔△

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北十堰442008；2.十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北十堰442011）

原發(fā)性肝癌（HCC）是世界上常見的惡性腫瘤之一，近幾年的發(fā)病率呈上升趨勢，其病因和發(fā)病機制尚未清楚[1]。HCC的耐藥性是HCC晚期患者預(yù)后差和易復(fù)發(fā)的主要原因之一，因此，探索HCC耐藥性機制和尋找有效治療HCC的方法是研究人員最關(guān)心的問題之一。目前，有近100多種抗癌藥物用于HCC的治療，而化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）是治療大多數(shù)早期癌癥如結(jié)直腸癌[2]、乳腺癌[3]、食管癌[4]以及原發(fā)性肝癌[5]有效的抗癌藥物。然而，由于中晚期癌癥患者對5-FU的耐藥性從而限制了其在臨床上的應(yīng)用，更為重要的是使用5-FU的患者容易對其他化療藥物產(chǎn)生耐藥性[6-7]。

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）的發(fā)現(xiàn)提示為什么5-FU能有效治療早期癌癥患者，而對晚期癌癥失效甚至對患者造成嚴重的不良反應(yīng)[8-9]。研究認為5-FU能夠靶向識別并抑制無限增殖和已分化的肝癌細胞，而對未分化的CSCs不起作用，提示CSCs是導(dǎo)致患者預(yù)后差和易復(fù)發(fā)最直接的原因[10]。最近，Gupta等[11]通過高通量篩選技術(shù)對16 000種抑制人乳腺癌CSCs的化合物進行篩選，發(fā)現(xiàn)只有沙利霉素（salinomycin，Sal）能選擇性抑制乳腺癌CSCs的增殖。研究發(fā)現(xiàn)Sal能抑制骨肉瘤CSCs和子宮內(nèi)膜CSCs的增殖[12-13]；近新研究證實Sal能抑制CD133＋陽性（干細胞生物標志物）肝癌細胞和胰腺癌細胞的增殖[14-15]。這些研究結(jié)果提示5-FU與Sal聯(lián)合作用對處于不同階段的癌細胞發(fā)揮抑制作用。因此，本文將5-FU與Sal聯(lián)合作用研究這種聯(lián)合作用是否能增加HCC對5-FU的敏感性從而殺死HCC干細胞，探討HCC發(fā)生與發(fā)展的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞（中科院上海細胞生物研究所）；5-FU和MTT（Sigma公司）；沙利霉素（宜昌永諾藥業(yè)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素（北京鼎國生物公司）；AnnexinV-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒（成都艾特姆生物科技公司）；兔抗人CD133、EPCAM、p-GSK-3β-Tyr216、βactin抗體（Santa公司）；p-β-catenin抗體、β-catenin（Cell Signaling Technology公司）；辣根標記山羊抗兔IgG二抗購自中杉金橋公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2，SMMC-7721和MHCC-97H細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。待細胞融合度達到80%左右時進行細胞傳代。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞以4.5×104個／孔接種于96孔板中，每孔100μL，設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，各加入200 μL含不同終濃度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）和Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培養(yǎng)基，同時設(shè)置對照組（含DSMO的DMEM培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)24、48、72h。后加入20μL 5mg／mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入150μL DMSO，振蕩使結(jié)晶完全溶解，用酶標儀測定492nm處的吸光值（OD值）。重復(fù)3次，按公式（1）計算細胞增殖抑制率。

1.2.3 5-FU和Sal聯(lián)合作用 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞以細胞密度為4.5×104個／孔接種于96孔板中，每孔100μL，設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，分別混合交叉加入200μL含不同終濃度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）＋Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培養(yǎng)基，同時設(shè)置對照組（含DSMO的DMEM培養(yǎng)基），培養(yǎng)48h后運用MTT法測定每孔OD值。

1.2.4 克隆形成實驗 將增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞離心收集后計數(shù)，以200個／皿接種于10cm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h；向培養(yǎng)皿中加入5-FU和Sal使其終濃度分別為8μg／mL和4μg／mL，同時設(shè)置對照組，培養(yǎng)12d，直到通過肉眼能清晰觀察到可見的細胞克?。粚⑴囵B(yǎng)基倒掉，PBS洗滌，甲醇固定10min，PBS洗滌，吉姆薩染色10 min，自來水清洗，晾干后計數(shù)，按公式（2）計算細胞克隆形成率。

1.2.5 流式細胞實驗 將增殖期的SMMC-7721細胞經(jīng)消化后接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，按下列實驗因素作用細胞：PBS組，5-FU（8μg／mL），Sal（4μg／mL），5-FU（8 μg／mL）＋Sal（4μg／mL），作用48h后用PBS洗滌3次，消化離心收集細胞。按照Annexin-V／PI試劑盒說明書操作，先加入500μL的Binding buffer重懸細胞，再加入5μL FITC標記的Annexin-V和5μL PI混勻，室溫下避光孵育15min，運用流式細胞儀測定細胞凋亡。將生長狀態(tài)良好的SMMC-7721細胞經(jīng)相同的方法分組處理后離心收集細胞，用藻紅蛋白偶聯(lián)的CD133抗體和FITC偶聯(lián)的EPCAM抗體4℃孵育30min，同時以加入藻紅蛋白偶聯(lián)的鼠IgG作為對照。死細胞通過標記7-放線菌素D識別，運用流式細胞儀測定CD133（＋）-EPCAM（＋）陽性SMMC-7721細胞。

1.2.6 Western blot檢測 將增殖期的SMMC-7721細胞經(jīng)消化后接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后棄掉培養(yǎng)基，按實驗1.2.5方法處理細胞，作用48h后收集細胞。細胞經(jīng)RIPA細胞裂解液提取總蛋白，按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。將總蛋白50μg進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育一抗（p-GSK-3β-Tyr216，p-β-catenin，βcatenin和β-actin抗體），4℃過夜。洗膜、加入辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶2 000）室溫孵育1h。照片經(jīng)ECL后掃描，蛋白表達灰度值經(jīng)Quanity-One軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標準誤差（mean±SEM）表示。組間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差分析后的成對比較采用S-N-K分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-FU和Sal抑制肝癌細胞的增殖 5-FU和Sal均能抑制肝癌細胞的增殖，細胞抑制率與濃度呈時間-劑量依賴效應(yīng)，見圖1。相同條件下，Sal對肝癌細胞的抑制作用大于5-FU對肝癌細胞的抑制作用，當5-FU和Sal濃度分別為8μg／mL和4μg／mL時細胞抑制率達到最大，5-FU和Sal對SMMC-7721細胞的抑制作用大于HepG2和MHCC-97H細胞。因此，在細胞凋亡實驗和機制研究中以SMMC-7721細胞為研究對象。

圖1 MTT法測定5-FU和Sal對肝癌細胞增殖的影響

表15 -FU與Sal聯(lián)合作用對HepG2細胞增殖的影響（±s）

表15 -FU與Sal聯(lián)合作用對HepG2細胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.248±0.035 0.312±0.006 0.348±0.023 0.471±0.021 2 0.319±0.025 0.446±0.078 0.523±0.018 0.541±0.091 0.583±0.033 4 0.412±0.081 0.519±0.062 0.562±0.091 0.633±0.048 0.715±0.042 8 0.513±0.059 0.573±0.088 0.611±0.102 0.682±0.055 0.748±0.072 16 0.588±0.042 0.650±0.079 0.739±0.083 0.783±0.031 0.899±0.038

表2 5-FU與Sal聯(lián)合作用對SMMC-7721細胞增殖的影響（±s）

表2 5-FU與Sal聯(lián)合作用對SMMC-7721細胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.300±0.034 0.394±0.016 0.431±0.045 0.498±0.011 2 0.368±0.022 0.476±0.066 0.583±0.065 0.562±0.085 0.611±0.067 4 0.472±0.063 0.587±0.054 0.605±0.077 0.671±0.044 0.775±0.009 8 0.549±0.021 0.598±0.021 0.641±0.062 0.702±0.035 0.808±0.058 16 0.602±0.044 0.682±0.032 0.782±0.073 0.795±0.062 0.914±0.073

表3 5-FU與Sal聯(lián)合作用對MHCC-97H細胞增殖的影響（±s）

表3 5-FU與Sal聯(lián)合作用對MHCC-97H細胞增殖的影響（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.285±0.088 0.361±0.022 0.415±0.055 0.444±0.063 2 0.341±0.015 0.442±0.047 0.548±0.079 0.541±0.089 0.591±0.059 4 0.428±0.033 0.538±0.081 0.585±0.041 0.649±0.081 0.682±0.029 8 0.505±0.063 0.567±0.034 0.602±0.064 0.684±0.077 0.778±0.066 16 0.582±0.058 0.665±0.051 0.713±0.057 0.735±0.041 0.854±0.091

2.2 5-FU和Sal聯(lián)合作用對肝癌細胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示5-FU和Sal聯(lián)合作用肝癌細胞48h后，細胞抑制率明顯高于5-FU或Sal單獨作用肝癌細胞時的抑制率，并且隨著5-FU或（和）Sal濃度的增加，這種協(xié)同作用越強。結(jié)果顯示，SMMC-7721細胞對5-FU和Sal協(xié)同作用的敏感性大于HepG2和MHCC-97H細胞，提示5-FU和Sal協(xié)同作用對不同的癌細胞存在差異性（表1～3）。結(jié)果證實，5-FU和Sal對肝癌細胞增殖抑制具有協(xié)同作用，且對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用最強。

2.3 5-FU和Sal協(xié)同作用抑制肝癌細胞克隆形成 5-FU（8 μg／mL）、Sal（4μg／mL）和5-FU（8μg／mL）＋Sal（4μg／mL）分別作用HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞48h后，肝癌細胞增殖能力被顯著抑制（P＜0.01）。當5-FU＋Sal共同作用肝癌細胞時表現(xiàn)出協(xié)同作用，肝癌細胞的克隆數(shù)顯著低于5-FU或Sal單獨作用細胞時的克隆數(shù)，見圖2。

2.4 5-FU和Sal聯(lián)合作用對SMMC-7721細胞凋亡的影響 MTT和克隆形成實驗結(jié)果已表明，5-FU和Sal對HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H細胞的增殖抑制具有協(xié)同作用，而且這一作用對SMMC-7721細胞最為明顯。而流式細胞術(shù)檢測5-FU和Sal對SMMC-7721細胞凋亡結(jié)果如圖3顯示，5-FU和Sal濃度為8μg／mL和4μg／mL時，SMMC-7721細胞凋亡率分別為（18.52±3.45）%和（20.64±2.15）%；當二者聯(lián)合作用時，SMMC-7721細胞凋亡率達到（27.93±3.56）%，明顯高于二者單獨作用時的細胞凋亡率。

圖2 5-FU和Sal聯(lián)合作用對肝癌細胞單克隆形成的影響

2.5 5-FU和Sal聯(lián)合作用對肝癌細胞SMMC-7721腫瘤干細胞的影響 利用流式細胞儀測定SMMC-7721細胞經(jīng)5-FU、Sal、5-FU和Sal作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）陽性SMMC-7721細胞水平，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細胞經(jīng)5-FU作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）細胞數(shù)量從（28.5±3.71）%增加到（47.9±4.33）%（P＜0.01）；而細胞經(jīng)Sal作用后CD133（＋）-EPCAM（＋）細胞數(shù)量顯著降低，從（28.5±3.71）%降低到（15.7±2.15）%（P＜0.01）。當5-FU和Sal聯(lián)合作用細胞后CD133（＋）-EPCAM（＋）陽性SMMC-7721細胞數(shù)與5-FU單獨作用時的細胞數(shù)比顯著降低，從（47.9± 4.33）%降低到（31.47±5.26）%，（P＜0.01），見圖4。

圖3 流式細胞儀檢測5-FU和Sal對SMMC-7721細胞凋亡的影響

圖4 5-FU和Sal對SMMC-7721腫瘤干細胞增殖的影響

2.6 Sal能抑制Wnt／β-catenin信號通路 研究證實Wnt／βcatenin信號通路參與致瘤性肝臟祖細胞活性的調(diào)節(jié)，外在作用下激活肝臟祖細胞轉(zhuǎn)化為肝癌細胞[17-18]。Western-blot檢測結(jié)果如圖5所示，與5-FU處理組比較，Sal和聯(lián)合作用組細胞中p-GSK-3β（Tyr216）蛋白表達量顯著增加；p-β-catenin蛋白表達量在Sal處理組細胞中明顯升高，當二者聯(lián)合作用時降低。

圖5 Western-blot檢測5-FU和Sal對SMMC-7721細Wnt／β-catenin信號通路蛋白表達影響

3 討論

在HCC患者中，僅有30%～40%患者符合根治性治療，這些治療手段包括手術(shù)切除，肝移植以及肝動脈栓塞化療，大多數(shù)患者希望通過化療來延長生命。最新數(shù)據(jù)顯示HCC腫瘤干細胞對化療藥物（例如5-FU）表現(xiàn)出抗藥性。研究表明，EPCAM和CD133蛋白是肝癌細胞Huh7中腫瘤干細胞膜表面的生物標志物[16]。以抑制腫瘤干細胞增殖為出發(fā)點用作臨床治療還面臨諸多挑戰(zhàn)，因為在殺死癌細胞和腫瘤干細胞的時候可能需要多種藥物聯(lián)合作用。Sal是一種抗生素，能殺滅細菌，霉菌和寄生微生物，最新的研究表明，Sal能選擇性殺死乳腺癌腫瘤干細胞[12]和結(jié)腸癌腫瘤干細胞[19]。研究發(fā)現(xiàn)Sal能抑制HCC細胞中CD133陽性細胞的增殖[15]。考慮到Sal這一獨特功能，本文以3種人肝癌細胞株為研究對象研究5-FU和Sal素聯(lián)合作用能否提高HCC細胞對5-FU的敏感性。

本研究探討了Sal能否降低肝癌細胞對5-FU的抗藥性。CD133和EPCAM蛋白是一種膜蛋白，在肝癌細胞中被視為腫瘤干細胞生物標志物[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞Huh7細胞中存在CD133（＋）-EpCAM（＋）陽性細胞[22]。本研究顯示5-FU和Sal聯(lián)合作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）陽性細胞數(shù)量顯著降低，而5-FU單獨作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）陽性細胞數(shù)量明顯增加；克隆形成實驗結(jié)果顯示二者聯(lián)合作用顯著抑制肝癌細胞的克隆形成。這一作用可能的原因是5-FU和Sal聯(lián)合作用抑制肝癌細胞中CD133（＋）-EpCAM（＋）陽性細胞的增殖，提示通過Sal抑制肝癌細胞腫瘤干細胞的增殖來提高HCC細胞對5-FU的敏感性。研究證實Wnt／β-catenin信號通路的激活或抑制與癌細胞抗藥性密切相關(guān)[23]；Wnt／βcatenin信號通路在維持干細胞處于未分化狀態(tài)方面起著重要作用[24]。β-catenin蛋白是Wnt／β-catenin信號通路中的重要組成部分，而Gsk-3β蛋白是β-catenin基因的上游調(diào)控因子，在外界條件的刺激下Gsk-3β蛋白與β-catenin蛋白結(jié)合進而使其發(fā)生磷酸化而降解。經(jīng)典的Wnt信號通路由β-catenin蛋白介導(dǎo)，激活型β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)移的積累可促進肝癌細胞對5-FU的抗藥性。本研究發(fā)現(xiàn)Sal、5-FU＋Sal分別作用肝癌細胞后細胞通過上調(diào)β-GSK-3β（Tyr216）的表達抑制激活型β-catenin蛋白的表達，提示5-FU可抑制Wnt／β-catenin信號通路，而Sal和5-FU聯(lián)合作用可使這一功能得以恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)Sal通過抑制HCC細胞中腫瘤干細胞的增殖來提高HCC細胞對5-FU的敏感性。由此推測，除了5-FU之外，仍有大量的化療藥物可能通過促進腫瘤干細胞增殖的途徑使其對癌細胞治療失去作用。本研究為臨床對化療藥物失敏的HCC患者提供了新的治療方案。

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