余文杰　沈孝坤

[摘要] 目的 探討膜聯(lián)蛋白Ⅱ在乳腺癌中的表達(dá)以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響。 方法 分別采用免疫組化方法檢測(cè)AnnexinⅡ蛋白在正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況，并測(cè)定高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株及低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡ mRNA（RT-PCR法）以及蛋白（蛋白印記技術(shù)）的表達(dá)情況。 結(jié)果 AnnexinⅡ在正常乳腺組織中主要表達(dá)在間質(zhì)內(nèi)，在乳腺導(dǎo)管上不表達(dá)，在導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中間質(zhì)、血管、腫瘤組織上均有表達(dá)。AnnexinⅡ在正常乳腺組織表達(dá)的IOD值為（6.5±1.0）×106，在導(dǎo)管原位癌中表達(dá)的IOD值為（27.5±3.0）×106，在侵襲性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的IOD值為（40.0±11.0）×106。三組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織，而侵襲性導(dǎo)管癌中的表達(dá)量顯著高于導(dǎo)管原位癌（均P < 0.01）。AnnexinⅡ mRNA在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)灰度值（0.83±0.11）顯著高于MCF-7株中的表達(dá)（0.07±0.01），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；AnnexinⅡ蛋白在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)（1.47±0.08）顯著高于MCF-7株中的表達(dá)（0.11±0.03），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 AnnexinⅡ在乳腺癌中高表達(dá)，并且瘤細(xì)胞侵襲性越強(qiáng)，其表達(dá)也越強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；增殖；膜聯(lián)蛋白Ⅱ

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（b）-0004-04

[Abstract] Objective To discuss expression of Annexin Ⅱ in breast cancer and the effects on the invasion of breast cancer cells. Methods Annexin Ⅱ expression in normal breast tissue， ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues were detected by immunohistochemical method， and Annexin Ⅱ mRNA （RT-PCR） and protein （Western blot） expressions in high invasive breast cancer cell lines and low invasive breast cancer cell lines were detected. Results In normal breast tissue， Annexin Ⅱ was mainly detected in troma， without expression on breast catheter. In ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues， Annexin Ⅱ was detected in troma， vessel and tumor tissue. IOD of Annexin Ⅱ expression in normal breast tissue was （6.5±1.0）×106， in ductal carcinoma was （27.5±3.0）×106， and in invasive ductal carcinoma tissues was （40.0±11.0）×106. There was significant difference in three groups （P < 0.01）. IOD of Annexin Ⅱ expression in invasive ductal carcinoma tissues and ductal carcinoma was higher than that in normal breast tissue， and IOD of Annexin Ⅱ expression in invasive ductal carcinoma tissues was higher than that in ductal carcinoma （all P < 0.01）. Gray value of AnnexinⅡ mRNA expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was （0.83±0.11）， which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7 （0.07±0.01）， and there was significant difference between two cell lines （P < 0.01）. IOD of AnnexinⅡ protein expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was （1.47±0.08）， which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7 （0.11±0.03）， and there was significant difference between two cell lines （P < 0.01）. Conclusion Annexin Ⅱ shows high expression in breast cancer， and the stronger aggressive of tumor cells is， the higher expression of it is.

[Key words] Breast cancer； Multiplication； Annexin Ⅱ

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)乳腺癌的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。膜聯(lián)蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是一種磷脂結(jié)合蛋白，具有鈣離子依賴性，主要以單體、二聚體和四聚體的形式存在，四聚體是2個(gè)AnnexinⅡ蛋白單體與2個(gè)s100A10（P11）單體組成[1-3]。AnnexinⅡ和s100A10組成的四聚體只存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，而細(xì)胞核中AnnexinⅡ以單體形式存在。AnnexinⅡ參與細(xì)胞的分泌、增殖、細(xì)胞骨架連接等生物學(xué)功能，還能直接結(jié)合到原癌基因（c-myc）mRNA上，上調(diào)c-Myc蛋白[4-6]。研究顯示AnnexinⅡ在多種腫瘤中有過(guò)表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[7-8]。本研究通過(guò)比較正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌中AnnexinⅡ水平，分析AnnexinⅡ在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，通過(guò)比較高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株及低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡ的表達(dá)情況，分析AnnexinⅡ在乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞株

正常乳腺組織以及乳腺癌組織均由浙江省臺(tái)州醫(yī)院病理室提供。人乳腺癌細(xì)胞株包括高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s株和低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

小鼠抗人AnnexinⅡ單克隆抗體，小鼠抗人β-actin單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗上樣IgG，由美國(guó)Santa Cruz公司提供；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，SP免疫組化試劑盒，由上海鑫樂(lè)生物科技有限公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)箱，雙垂直板蛋白電泳槽，電泳儀，凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AnnexinⅡ在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本脫蠟，加入3% H2O2浸泡，去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，清水沖洗2次，加入0.01 mol/L的檸檬酸，蒸煮3 min，冷卻后再蒸煮1次，冷卻，抗原修復(fù)。水洗2次后將載玻片放置于PBS液中5 min洗2次，擦干，加正常山羊/兔血清封閉，37℃溫箱中放置30 min。加一抗，4℃保存過(guò)夜，置于37℃下復(fù)溫后在PBS液中沖洗5 min，3次，加二抗，37℃溫箱中放置20 min。PBS沖洗5 min，3次，加SABC，37℃溫箱內(nèi)放置30 min。PBS液沖洗5 min，3次，加DAB顯色液。清水沖洗后浸泡入蘇木精復(fù)染1 min。脫水，封片。在顯微鏡下觀察圖像，并采用軟件分析染成黃色區(qū)域的累積光密度（IOD）值。

1.3.2 AnnexinⅡ mRNA以及蛋白在高侵襲人乳腺癌細(xì)胞株以及低侵襲人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá) MDA-MB-435s以及MCF-7細(xì)胞株接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用RT-PCR方法測(cè)定AnnexinⅡ mRNA的表達(dá)情況。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。提取乳腺癌細(xì)胞的總RNA，所得RNA行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)，50 μL體系，預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 35 s，延伸72℃ 5 min。其中變性-退火-延伸循環(huán)28次。凝膠電泳成像，分析灰度值。采用Western blot測(cè)定人乳腺癌細(xì)胞中AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)。提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，顯色，采用Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AnnexinⅡ在正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)

AnnexinⅡ在正常乳腺組織中主要表達(dá)在間質(zhì)內(nèi)，在乳腺導(dǎo)管上不表達(dá)，在導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中在間質(zhì)、血管、腫瘤組織上均有表達(dá)。AnnexinⅡ在正常乳腺組織表達(dá)的IOD值為（6.5±1.0）×106，在導(dǎo)管原位癌中表達(dá)的IOD值為（27.5±3.0）×106，在侵襲性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的IOD值為（40.0±11.0）×106。三組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織，而侵襲性導(dǎo)管癌中的表達(dá)量顯著高于導(dǎo)管原位癌（均P < 0.01）。見(jiàn)圖1～4。

2.2 AnnexinⅡ mRNA及蛋白在不同人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

AnnexinⅡ mRNA在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)顯著高于MCF-7株中的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；AnnexinⅡ 蛋白在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)顯著高于MCF-7株中的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

3 討論

Annexin Ⅱ是一種依賴鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白，又名P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-IV。其基因位于15q21-q22，蛋白分子量為36 kD，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富。以單體、二聚體以及四聚體方式存在，不同的形式生物學(xué)功能不同。人AnnexinⅡ的結(jié)構(gòu)基因位于15q21-q22，含1.4 kb編碼基因，并有3個(gè)假基因分別位于4號(hào)、9號(hào)、10號(hào)染色體上。人AnnexinⅡ結(jié)構(gòu)基因含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。AnnexinⅡ由339個(gè)氨基酸殘基組成，是Annexins家族A亞家族成員。與該家族其他成員一樣，它在結(jié)構(gòu)上都具有一個(gè)保守的羧基末端和一個(gè)可變的氨基末端。保守的羧基末端一般具有4個(gè)Annexin重復(fù)子，每一個(gè)重復(fù)子由大約70個(gè)高度保守氨基酸殘基構(gòu)成。每一個(gè)重復(fù)子有5個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，它們堆疊成致密的圓盤狀。該結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合鈣離子的能力，從而調(diào)節(jié)Annexin分子與磷脂分子的結(jié)合，故被稱為所有Annexins家族成員的核心區(qū)域，被鈣離子活化后可與膜磷脂結(jié)合的蛋白，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面其他一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)。

AnnexinⅡ除了在細(xì)胞分泌、增殖、細(xì)胞骨架連接、纖溶等方面發(fā)揮重要的作用外，其還具有結(jié)合RNA的作用，結(jié)合到c-mycmRNA上，可上調(diào)c-Myc蛋白。越來(lái)越多的研究顯示，AnnexinⅡ在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。孟鑫等[9]研究顯示AnnexinⅡ在胃癌中高表達(dá)。陳輝等[10]研究顯示AnnexinⅡ可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展。AnnexinⅡ四聚體在腫瘤的遷移過(guò)程中充當(dāng)了組織型纖溶酶原活化劑、纖溶酶原的受體，產(chǎn)生活化的纖溶酶，活化基質(zhì)金屬蛋白酶，從而參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程[11-13]。

本研究對(duì)正常乳腺組織、乳腺癌組織中AnnexinⅡ的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示AnnexinⅡ在正常乳腺組織內(nèi)僅僅表達(dá)在組織間質(zhì)，在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)，但是在乳腺癌的上皮細(xì)胞胞質(zhì)以及胞膜內(nèi)均呈現(xiàn)高表達(dá)，并且在乳腺癌組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞上也出現(xiàn)高表達(dá)。通過(guò)IOD進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，AnnexinⅡ在侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)最高，在導(dǎo)管原位癌組織中的表達(dá)其次，在正常乳腺組織中的表達(dá)最低。提示AnnexinⅡ可能與乳腺癌的侵襲有關(guān)。為了進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，分別選擇了高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s以及低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行研究，分析不同侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡ mRNA以及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s株中AnnexinⅡ mRNA以及蛋白的表達(dá)均顯著高于低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞MCF-7株。這進(jìn)一步證實(shí)AnnexinⅡ可能與乳腺癌腫瘤細(xì)胞的侵襲性相關(guān)。

既往的定位研究顯示，AnnexinⅡ在細(xì)胞內(nèi)的分布廣泛，不僅存在于細(xì)胞漿內(nèi)，還存在于細(xì)胞核[14-15]。細(xì)胞漿內(nèi)的兩個(gè)AnnexinⅡ與2個(gè)s100A10形成四聚體，借助AnnexinⅡ的親鈣特性以及磷脂性轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。AnnexinⅡ可調(diào)節(jié)s100A10水平，并且能夠屏蔽細(xì)胞內(nèi)s100A10的泛素化信號(hào)，從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)s100A10蛋白水平。另外單體或者四聚體的AnnexinⅡ均能夠結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白，發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用[16-17]。AnnexinⅡ還是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因，AnnexinⅡ單體可作為蛋白復(fù)合物的一部分，發(fā)揮增強(qiáng)DNA聚合酶α活性的作用，促進(jìn)合成DNA[15]。AnnexinⅡ蛋白還可作為RNA結(jié)合蛋白，結(jié)合PolyG以及c-myc基因的mRNA上，形成mRNP，發(fā)揮調(diào)節(jié)c-myc基因mRNA翻譯的作用，而c-Myc蛋白參與了細(xì)胞的增殖、代謝、更新、分化、凋亡[18]。丁滔等[19]研究顯示，AnnexinⅡ在不同Gleason評(píng)分、前列腺特異性抗原水平、臨床分期、不同危險(xiǎn)度中的表達(dá)存在顯著差異，認(rèn)為AnnexinⅡ表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，AnnexinⅡ在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且隨著腫瘤細(xì)胞侵襲性的增強(qiáng)，其表達(dá)水平也顯著升高。提示其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的作用。本次研究并沒(méi)研究AnnexinⅡ在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，期望在今后的工作中能夠進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Tomas A，F(xiàn)utter C，Moss SE. AnnexinⅡis required for midbody formation and completion of the terminal phase of cytokinesis [J]. J Cell Biol，2004，165（6）：813-822.

[2] 王萬(wàn)之，丁厚中，史恩溢，等.MTSS1、Ezrin及Annexin Ⅱ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，22（3）：265-268.

[3] Semov A，Moreno MJ，Onichtchenko A，et al. Metastasis-asso-ciated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin Ⅱ and accelerated plasmin formation [J]. J Biol Chena，2005，280（21）：20833-20841.

[4] 張瓊，譚小軍，何利珍.Annexin Ⅱ蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，44（3）：175-177.

[5] Sharma MR，Koltowski L，Ownbey RT，et al. Angiogenesis-as-sociated protein annexin Ⅱ in breast cancer：selective expression in invasive breast cancer and contribution to tumor invasion and progression [J]. Expe Mol Pathol，2006， 81（2）：146-156.

[6] Tomas A，F(xiàn)utter C，Moss SE. AnnexinⅡis required for midbody formation and completion of the terminal phase of cytokinesis [J]. J Cell Biol，2004，165（6）：813-822.

[7] 黨秋紅，曾憲旭，班振英，等.乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，47（2）：159-162.

[8] 楊謹(jǐn)，程婷婷，王麗娜，等.腎透明細(xì)胞癌中AnnexinⅡ的表達(dá)及其臨床意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（1）：59-62.

[9] 孟鑫，李振想，姜孝奎.膜聯(lián)蛋白Ⅱ和鈣衛(wèi)蛋白在胃癌中的表達(dá)[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（8）：655-656.

[10] 陳輝，段智，韋妹艷.甲狀腺乳頭狀癌組織CD147、MMP-2、AnnexinⅡ的檢驗(yàn)價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2014，12（14）：174-175.

[11] Zimmermann U，Woenckhaus C，Pietschmann S，et al. Expression of Annexin Ⅱ in conventional renal cell carcinoma is correlated with Fuhrman grade and clinical outcome [J]. Virchows Arch，2004，445（4）：368-374.

[12] Ohno Y，Izumi HI，Kawamura T，et al. Annexin Ⅱ represents meta-static potential in clear-cell renal cell carcinoma [J]. Br J Cancer，2009，101（2）：87-294.

[13] 黨秋紅，葉明，曾憲旭，等.MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].腫瘤預(yù)防與治療，2011， 24（4）：146-149.

[14] 黃器偉，李道明，黃培，等.AnnexinⅡ、S100A4在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義[J].腫瘤防治研究，2011，38（12）：1397-1400.

[15] Esposito I，Penzel R，Chaib-Harrireche M，et al. Tenascin C and annexin Ⅱ expression in the process of pancreatic carcinogenesis [J]. J Pathol，2006，208（5）：673-685.

[16] 楊根榮，趙松.Annexin Ⅱ、Cathepsin B在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31（4）：574-576.

[17] Emoto K，Yamada Y，Sawada H，et al. Annexin Ⅱ over expression correlates with stromal tenascin-C overexpression：a prognostic marker in colorectal carcinoma [J]. Cancer，2001，92（6）：1419-1426.

[18] Mai JX，F(xiàn)inley RL，Waisman Jr DM，et al. Human Procathepsin B interacts with the annexin Ⅱ tetramer on the surface of tumor cells [J]. J Biol Chem，2000，275（17）：12806-12812.

[19] 丁滔，趙正平，洪斌，等.膜聯(lián)蛋白Ⅱ的表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].臨床泌尿外科雜志，2012， 27（7）：488-493.

（收稿日期：2014-10-10 本文編輯：張瑜杰）