鄔振華 李群 崔翔 沈志森

[摘要] 目的 探討miR-196a在下咽鱗狀細(xì)胞癌（HSCC）患者血漿中的表達(dá)水平及其與下咽癌臨床因素的關(guān)系，明確miR-196a的診斷價(jià)值及臨床意義。 方法 利用57例臨床確診HSCC患者血漿配對(duì)樣本，健康體檢者血漿樣本50例，從血漿標(biāo)本中提取總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）方法檢測(cè)miR-196a在血漿中的表達(dá)水平，收集57例HSCC患者病理、臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析血漿miR-196a水平和臨床病理特征的關(guān)系。構(gòu)建受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），探討血漿miR-196a的診斷價(jià)值。結(jié)果 在HSCC患者中術(shù)前miR-196a的水平9.11（5.69，12.43）顯著高于術(shù)后12.69（9.16，14.84）及健康體檢者12.85（11.18，14.91）（P<0.01）；血漿標(biāo)本中HSCC患者術(shù)后miR-196a水平與健康體檢者比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。miR-196a血漿中的表達(dá)水平和分化程度（P<0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.01）、臨床分期（P<0.05）有顯著相關(guān)性；與年齡、吸煙史無(wú)關(guān)（P>0.05）。ROC曲線下面積為0.755，截?cái)啵╟ut-off）值為△Ct=10.84，95%CI：0.66～8.85 （P<0.01）。結(jié)論 血漿miR-196a血漿表達(dá)水平與HSCC患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型等若干臨床特征相關(guān)。miR-196a有望作為HSCC微創(chuàng)診斷分子標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] miRNA；下咽癌；腫瘤標(biāo)志物；診斷

[中圖分類號(hào)] R759.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）03-0011-05

下咽癌是耳鼻喉科常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，其中約95%為下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC），多發(fā)生在梨狀窩、下咽后壁及環(huán)后區(qū)[1，2]。下咽癌起病隱匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，多數(shù)下咽癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已伴隨腫瘤浸潤(rùn)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，主要治療方法包括手術(shù)、放化療、分子靶向藥物治療[2]。術(shù)后患者發(fā)音、吞咽功能均受到不同程度影響，5年生存率約31.4%[3]。因此，下咽癌患者的早期診斷，對(duì)患者的預(yù)后及生活質(zhì)量影響起著至關(guān)重要的作用。但是目前沒有可靠的分子標(biāo)志物診斷下咽癌及預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移，故探索下咽癌診斷分子標(biāo)志物十分重要。

通過分子生物學(xué)研究探索下咽癌的分子機(jī)制，為下咽癌的病因研究及診治提供了新方向。微小RNA（miRNA） 是一種內(nèi)源性長(zhǎng)度為22～25 nt的非編碼RNA，它可以通過特異性地與癌基因或者抑癌基因結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4-5]，許多研究證明miRNA參與了腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程[4]。Mitchell等通過實(shí)驗(yàn)證明miRNA能夠在血漿和血清中穩(wěn)定存在，隨后大量研究者證明miRNA可以作為潛在的腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的血液標(biāo)志物[6-8]。本研究通過檢測(cè)下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC）患者及健康體檢者外周血中的miR-196a的水平，探討其在下咽癌的診斷中的作用。

1資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月～2013年11月李惠利醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的57例下咽癌手術(shù)患者和50例健康體檢者血漿標(biāo)本。下咽癌標(biāo)本來(lái)源均為男性，病理診斷為HSCC；年齡43～81歲，平均60.1歲；術(shù)后病理按2002年UICC標(biāo)準(zhǔn)判斷下咽癌分期，組織類型及分化程度均由2名以上高年資病理醫(yī)師確診。57例下咽癌患者均無(wú)慢性肝病及肝、腎功能不全史。術(shù)前均未進(jìn)行放化療，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者43例，影像學(xué)檢查未見有明顯的其他器官轉(zhuǎn)移灶。健康體檢人群無(wú)腫瘤病史，年齡40～79歲，平均60.5歲。下咽癌患者和健康查體人群的年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。所有入組者均簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

MX3005P型全自動(dòng)熒光定量PCR儀（Stratagene， USA）、NanoDrop2000分光光度計(jì)、Trizol LS 裂解液（Invitrogen， USA）、miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（miScript HiSpec Buffer， miScript Reverse Transcriptase Mix）（Qiagen，德國(guó)）、miR-196a 10×miScript Primer Assay（Qiagen，德國(guó)），Hs_RNU6B_2 miScript Primer Assay（Qiagen，德國(guó)）、定量PCR反應(yīng)試劑盒（Qiagen，德國(guó)）。

1.3 標(biāo)本采集

下咽癌患者的術(shù)前血液標(biāo)本均在術(shù)前收集，術(shù)后1周收集空腹血液標(biāo)本。收集后置于ETDA抗凝管中，所有血液自收集至處理時(shí)間不超過2 h。血液樣本在4℃下、3 000 r/min離心10 min；取上層血漿置于新的1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管中，隨后在4℃下、12 000 r/min 離心10 min，獲取的血漿于 -80℃冰箱深度保存。

1.4 總RNA的提取

將臨床標(biāo)本從超低溫冰箱中取出，取250 μL血漿置于2 mL離心管中并加入750 μL Trizol LS，反復(fù)吹打混勻，在4℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min后，吸取上清置于1.5 mL去RNA酶離心管中，加入200 μL三氯甲烷，旋渦震蕩20 s，然后在4 ℃，12 000 r/min離心15 min后吸取上層水相，加入600 μL異丙醇靜置，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入1 mL 75%酒精，再次混勻。4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清。置于室外干燥 10 min，加入12 μL DEPC水溶解RNA并置于冰上備用。用NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度及OD值，OD260/OD280值在1.8～2.0之間的RNA樣品可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照逆轉(zhuǎn)錄miScript II Reverse Transcription （RT）試劑盒說(shuō)明書，將1 μg RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為37℃ 1 h，95℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄成功完成后，加入100 μL DEPC水備用。用5 μL cDNA為模板按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書加入10 μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR混合物、1 μL 10×miScript通用引物、1 μL特異性引物、3 μL DEPC水配制20 μL反應(yīng)體系。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)特異性miRNA的表達(dá)水平，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用閾值循環(huán)數(shù)Ct（Cycle threshold）來(lái)表示，并采用U6小RNA為內(nèi)參消除標(biāo)本誤差，實(shí)驗(yàn)引物均由Qiagen公司設(shè)計(jì)合成。特異性miRNA的相對(duì)表達(dá)水平用△Ct值表示，通過Mx3005P PCR System測(cè)出每個(gè)樣品的Ct值，通過公式：△Ct=（CtmiRNA-CtU6）計(jì)算△Ct值，△Ct值越高說(shuō)明樣本中表達(dá)水平越低。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)均以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)樣本間變異偏大，故兩配對(duì)樣本組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，臨床因素相關(guān)分組比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。構(gòu)建受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve， ROC），評(píng)價(jià)miR-196a的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-196a表達(dá)水平

HSCC患者術(shù)前血漿中miR-196a水平9.11（5.69， 12.43）顯著高于術(shù)后1周表達(dá)水平12.69（9.16，14.84）（圖1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=-4.57，P<0.01）。同時(shí)，收集50例健康體檢者血漿標(biāo)本并檢測(cè)miR-196a的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HSCC患者術(shù)前血漿中miR-196a水平亦顯著高于正常體檢者水平12.85（11.18，14.91）（u=-4.53，P<0.01）（圖2）。患者術(shù)后1周血漿中miR-196a的表達(dá)水平降至和正常人群血漿水平無(wú)顯著性差異（u=-0.69，P>0.05）。

圖 1 下咽癌患者術(shù)前血漿miR-196a水平明顯高于術(shù)后（P<0.01）

圖2 下咽癌患者術(shù)前血漿miR-196a水平顯著高于健康體檢人群（P<0.01）

2.2 下咽癌外周血血漿中miR-196a水平與臨床資料相關(guān)性分析

HSCC患者血漿miR-196a的水平與年齡（u=-0.36， P>0.05）、吸煙史（u=-0.60，P>0.05）等臨床因素?zé)o關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSCC患者血漿miR-196a水平與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（u=-3.78，P<0.01），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組miR-196a 血漿中的表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。在中低分化組中miR-196a血漿中的表達(dá)水平顯著高于高分化組（u=-2.49，P<0.05），且Ⅰ、Ⅱ期患者血漿中miR-196a顯著低于Ⅲ、Ⅳ期患者（u=-2.13，P<0.05）。見表1。

表1 下咽癌病例臨床特征與miR-196a水平的相關(guān)分析

2.3 miR-196a對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

通過構(gòu)建ROC曲線并計(jì)算CI，探討miR-196a能否作為HSCC的診斷標(biāo)志物的意義。ROC曲線下面積為0.755， cut-off值為10.84，95%CI為0.66～8.85（P<0.01），見封三圖2。

3 討論

血液檢測(cè)是患者住院檢查中的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，血液標(biāo)本較組織標(biāo)本更易于采集，且創(chuàng)傷小。甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原153（CA-153）等血液腫瘤標(biāo)志物已廣泛用于臨床。有研究證明miRNA 可與腫瘤相關(guān)靶基因的3非編碼區(qū)（untranslated regions，3UTRs）結(jié)合并在轉(zhuǎn)錄水平使其降解，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[9]。許多miRNA發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用[6-8]，并逐漸被用于腫瘤診斷并成為預(yù)后和療效評(píng)估的潛在標(biāo)志物[10]。通過檢測(cè)血漿中miRNA等腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平，有利于為腫瘤早期篩查、診斷提供依據(jù)。

下咽癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，此病起病隱匿，病理類型多為中低分化鱗狀細(xì)胞癌。腫瘤的病理分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度是影響下咽癌預(yù)后的重要因素。許多miRNA參與下咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程[11]。Orosz等[12]通過miRNA基因芯片技術(shù)構(gòu)建下咽癌的miRNA表達(dá)譜，并證明miR-21、miR-143、miR-155在下咽癌中顯著高表達(dá)。Hsu等[13]收集包括HSCC在內(nèi)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的血漿標(biāo)本后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-21水平在術(shù)前血漿標(biāo)本中較高，且顯著高于術(shù)后血漿標(biāo)本和健康對(duì)照組，提示miR-21是頭頸鱗狀細(xì)胞癌的新型的生物標(biāo)志物。同時(shí)Liu等[14]發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過抑制PTEN基因表達(dá)參與下咽癌的發(fā)生過程。還有研究顯示miR-504、miR-451a在HSCC中發(fā)揮著抑癌基因的作用[15，16]。

miR-196a由MIR-196A1（17q21.32，RP11基因）和MIR-196A2（12q13.13，HOX基因簇）基因轉(zhuǎn)錄并加工形成成熟的miRNA。許多研究表明miR-196a在惡性腫瘤中高表達(dá)，如食道癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等[17-19]。Luthra等[17]實(shí)驗(yàn)證明miR-196a在包括食道癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等在內(nèi)的12種細(xì)胞系中高表達(dá)，通過抑制miR-196a的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)的膜聯(lián)蛋白A1和miR-196a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Slater等[20]通過對(duì)胰腺癌患者外周血中miR-196a的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-196a在術(shù)前血中表達(dá)上調(diào)，腫瘤切除術(shù)后降至正常水平。Saito等[21]通過基因芯片技術(shù)篩選出喉癌組織標(biāo)本的miRNA芯片表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-196a在喉癌組織標(biāo)本中高表達(dá)，通過大樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芯片結(jié)果，并進(jìn)一步研究證實(shí)miR-196a參與了喉癌細(xì)胞的增殖過程。目前關(guān)于血液中檢測(cè)miR-196a的相關(guān)研究不多，且尚缺乏miR-196a和下咽癌關(guān)系的研究，因此本研究結(jié)合病理臨床因素分析miR-196a在血漿中的水平和下咽癌之間的關(guān)系并研究其診斷價(jià)值。

本研究表明，下咽癌術(shù)前血漿miR-196a水平明顯高于術(shù)后，且顯著高于健康體檢者血漿水平。通過構(gòu)建ROC曲線分析miR-196a的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，ROC曲線下面積達(dá)0.755。吸煙是導(dǎo)致頭頸部腫瘤的致病因素之一[22]，腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度往往影響腫瘤患者的預(yù)后，因此本研究結(jié)合以上臨床因素進(jìn)行相關(guān)性分析表明，血漿miR-196a水平和腫瘤的分期相關(guān)，晚期下咽癌血漿標(biāo)本中的表達(dá)量顯著高于早期下咽癌患者血漿中miR-196a的水平（P<0.05）。研究進(jìn)一步表明，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血漿中miR-196a水平也顯著提高（P<0.01），且中-低分化下咽鱗狀細(xì)胞癌患者中miR-196a較高分化患者高表達(dá)（P<0.05）。表明miR-196a可能是下咽鱗狀細(xì)胞癌的癌基因，miR-196a可能參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)過程。

目前尚無(wú)特異性的下咽癌血液診斷標(biāo)志物，本研究將為今后下咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物的研究奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步探討下咽癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)，miR-196a有望成為下咽癌診斷的潛在標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2014-10-28）