張洪海，竇海龍，陳 磊，沙未來(lái)，趙俊杰

1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 曲阜 273165 2 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875

中國(guó)狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

張洪海1,*，竇海龍1,2，陳 磊1，沙未來(lái)1，趙俊杰1

1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 曲阜 273165 2 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875

為了解中國(guó)狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育情況，從中國(guó)境內(nèi)狼的主要分布區(qū)青海、新疆、內(nèi)蒙古和吉林4個(gè)地區(qū)采集樣品，用分子生物學(xué)技術(shù)手段成功地獲得44個(gè)個(gè)體線粒體DNA控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR Ⅰ)序列和40個(gè)線粒體Cytb部分序列。線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ共檢測(cè)到51個(gè)變異位點(diǎn)，位點(diǎn)變異率為8.76%；線粒體Cytb部分序列發(fā)現(xiàn)31個(gè)變異位點(diǎn)，位點(diǎn)變異率為5.33%，未見(jiàn)插入及缺失現(xiàn)象，變異類型全部為堿基置換。共定義了16個(gè)線粒體HVR Ⅰ單倍型，其中吉林與內(nèi)蒙種群存在共享單倍型，估計(jì)這兩地間種群親緣關(guān)系較近。4個(gè)地理種群中新疆種群擁有較高的遺傳多樣性(0.94)。中國(guó)狼種群總體平均核苷酸多態(tài)性為2.27%，與世界其他國(guó)家地區(qū)相比，中國(guó)狼種群擁有相對(duì)較高的遺傳多樣性。通過(guò)線粒體HVR Ⅰ單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，中國(guó)狼在進(jìn)化上分為2大支，其中位于青藏高原的青海種群獨(dú)立為一支，推測(cè)其可能長(zhǎng)期作為獨(dú)立種群進(jìn)化?；谇嗪７N群與新疆，內(nèi)蒙種群的線粒體Cytb遺傳距離，推測(cè)中國(guó)狼2個(gè)世系可能在更新世冰川時(shí)期青藏高原受地質(zhì)作用急速隆起后出現(xiàn)分歧，分歧時(shí)間大約在1.1 MY前。

狼; 中國(guó); 遺傳多樣性; 系統(tǒng)進(jìn)化

灰狼簡(jiǎn)稱狼，屬于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬屬(Canis)，由于狼食譜寬、適應(yīng)性強(qiáng)，曾在地球上廣泛分布[1]。狼在我國(guó)曾一度分布于除海南省、南中國(guó)海諸島嶼以及臺(tái)灣省外的廣大地區(qū)，但由于人為捕殺和生境破壞，現(xiàn)僅集中分布于人口較為稀少的內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏等地區(qū)[2]。我國(guó)關(guān)于狼的研究主要集中在宏觀生態(tài)學(xué)方面，關(guān)于狼種群遺傳多樣性及系統(tǒng)分類地位的研究非常少，并且在狼亞種的劃分上還存在著眾多爭(zhēng)議：很多學(xué)者認(rèn)為中國(guó)狼或蒙古狼(CanislupusChanco)與歐亞狼(CanislupusLupus)是同一個(gè)亞種[3]；中國(guó)動(dòng)物志引述Pocock等和Ellerman 等的研究結(jié)論認(rèn)為分布于中國(guó)境內(nèi)的狼僅有蒙古狼(C.l.chanco)一個(gè)亞種[4-5]；王秀輝應(yīng)用RAPAD方法將中國(guó)狼劃分為5個(gè)亞種：云貴和東南集群亞種，東北河北群體亞種、甘肅群體亞種、內(nèi)蒙古群體亞種和新疆群體亞種[6]；羅理?xiàng)畹韧ㄟ^(guò)測(cè)定中國(guó)各個(gè)地區(qū)狼線粒體控制區(qū)部分序列得出分布于青海、西藏、云南的狼種群屬于西南種群亞種，東北種群與華北種群作為一個(gè)亞種，內(nèi)蒙古及新疆種群歸屬不能確定[7]。國(guó)內(nèi)對(duì)狼遺傳多樣性的研究未見(jiàn)報(bào)道，這對(duì)于野生狼種群的管理及保護(hù)非常不利。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)不會(huì)發(fā)生遺傳重組，較核DNA有更高的突變率，因此被公認(rèn)為用來(lái)作為研究動(dòng)物遺傳進(jìn)化的標(biāo)記物質(zhì)[8]。線粒體細(xì)胞色素b(Cytochrome b, Cytb)基因全長(zhǎng)大約在1100—1200 bp之間，并且不同物種間序列長(zhǎng)度差異較大，但是在核苷酸組成上卻具有偏好性。由于Cytb基因中含有突變和保守區(qū)，并且存在較慢和較快的進(jìn)化的密碼子位點(diǎn)，所以Cytb基因是對(duì)動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化研究的較好的分子標(biāo)記。犬科動(dòng)物線粒體控制區(qū)(Control region displacement loop, D-loop)全長(zhǎng)1240—1360 bp，其中存在3個(gè)保守序列框(Conserved sequence block)：CSB Ⅰ、CSB Ⅱ和CSB Ⅲ[9]。起始位點(diǎn)位于CSB Ⅰ區(qū)5′端的第一高變區(qū)(Hypervariable region, HVR Ⅰ)序列變異速率較快，常被用來(lái)進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)地理分析[10]。近些年來(lái)，保護(hù)生物學(xué)研究已經(jīng)深入到分子水平，要求使用分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)從大量動(dòng)物樣本中提取DNA以獲取動(dòng)物的遺傳信息。在采集分析樣品的過(guò)程中，傳統(tǒng)的取樣方法(通過(guò)殺死動(dòng)物來(lái)獲取新鮮的組織或捕獲動(dòng)物抽取血液)對(duì)于野外動(dòng)物種群特別是瀕危珍稀動(dòng)物種群較難實(shí)現(xiàn)。因此本研究采集了來(lái)自青海、新疆及內(nèi)蒙、吉林4個(gè)地區(qū)55個(gè)樣品，且多數(shù)樣品采用非損傷取樣的方法獲得。通過(guò)分子生物學(xué)手段成功獲得44個(gè)個(gè)體線粒體D-Loop區(qū)HVR Ⅰ序列和40個(gè)線粒體Cytb部分序列，對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)分析，探討各地種群遺傳多樣性高低并分析其系統(tǒng)進(jìn)化地位。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究于2011年12月至2012年6月分別在青新疆阿勒泰地區(qū)、內(nèi)蒙古西旗、內(nèi)蒙古達(dá)賚湖自然保護(hù)區(qū)、吉林圖門市共采集樣品55份，且樣品多數(shù)來(lái)自于野外捕捉的圈養(yǎng)狼(樣本詳細(xì)資料見(jiàn)表1)。所有糞便樣品一律置于-20 ℃冰箱中保存，肌肉組織置于-80 ℃冰箱中保存，采集皮毛組織均為自然風(fēng)干后置于常溫干燥環(huán)境下保存，血液樣品加入抗凝劑后使用生物低溫采樣箱運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中保存。

表1 狼樣品基本信息表Table 1 Basic information of all the wolves samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA的提取

由于在分子生物學(xué)研究中，應(yīng)用毛皮或者糞便樣品為DNA 來(lái)源時(shí)，獲得的DNA 含量相對(duì)于其他組織樣品較低，可能會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響以致無(wú)法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，因此針對(duì)這種情況，本研究采用重復(fù)提取的方法，對(duì)同一樣品分別獨(dú)立操作兩次，獲得的DNA分別置于-20℃冰箱保存并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。糞便中總DNA的提取使用糞便提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，USA)。血液，毛皮及肌肉組織DNA的提取使用血液及組織提取試劑盒(QIAamp DNeasy Blood & Tissue Kit，USA)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

狼線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ引物采用犬科動(dòng)物mtDNA D-loop第一高變區(qū)的序列長(zhǎng)度為582 bp通用引物對(duì)[11]:

L15404: 5′-CTCTTGCTCCACCATCAGC-3′

H16118: 5′ -AAACTATATGTCCTGAAACC-3′

根據(jù)Cytb內(nèi)部的保守位點(diǎn)，選擇性的擴(kuò)增了位于細(xì)胞色素b后半部分長(zhǎng)度大約767 bp的序列，其下游包含一段tRNApro序列。引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer 5.0及Oligo 7.5。所得引物序列為：

L14666：5′ -AGAGTGAATCTGAGGCGGCTT-3′

H15432：5′ -GCTTTGGGTGCTGATGGTGG-3′

狼控制區(qū)HVRⅠ和Cytb區(qū)PCR反應(yīng)體系相同: Taq 酶0.25 μL (Takara)，10 × buffer 4 μL，10 mmol/LdNTPs (Takara)3 μL，前/后引物各0.8 μL， BSA (Takara)0.25 μL，以及模板DNA 1 μL，加滅菌超純水至50 μL。

狼控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR Ⅰ)PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性4 min; 接下來(lái)40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 45 s)，最后72 ℃ 延伸5 min。Cytb區(qū)PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性4 min， 接下來(lái)40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收及測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用1.0%的常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量為5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer(Takara)，100 V電壓電泳30 min,凝膠經(jīng)EB染色后置于紫外下觀察將目的條帶切下，用凝膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit，USA)回收純化后送至北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析

測(cè)序所得序列結(jié)果在Genbank上經(jīng)Blast比對(duì)后確定序列來(lái)源于狼。用Clustal X軟件進(jìn)行DNA序列排列[12]，并輔以人工校對(duì)，以去掉擴(kuò)增的Cytb序列中所包含的線粒體tRNApro序列。基于Kimura雙參數(shù)距離模型(Kimura-2-Parameter，K2P)，通過(guò)MEGA 5.0計(jì)算各地理種群狼控制區(qū)HVR Ⅰ和Cytb序列變異堿基比例、變異類型、轉(zhuǎn)換和顛換比(R)及遺傳距離等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[13]?；诶荂ytb序列，利用遺傳距離和分子鐘的分歧時(shí)間計(jì)算公式為t=D/2a(t為分歧時(shí)間，D為遺傳距離，a為分子鐘)并結(jié)合已經(jīng)校正的哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素b序列的每百萬(wàn)年2%分子鐘來(lái)計(jì)算中國(guó)各地計(jì)算各地理種群進(jìn)化分歧時(shí)間[14-15]。基于狼控制區(qū)HVR Ⅰ序列用DnaSP 5.0[16]軟件劃分單倍型，將單倍型序列上傳至Genbank，單倍型序列登陸號(hào)見(jiàn)表4，并計(jì)算核苷酸多樣性(Nucleotidediversity，Pi)和單倍型多樣性 (Haplotypediversity,Hd)，進(jìn)而推算各地種群遺傳多樣性高低。為了研究中國(guó)各地狼的系統(tǒng)發(fā)育，結(jié)合本研究中發(fā)現(xiàn)的中國(guó)狼線粒體HVRⅠ單倍型及從Genbank中下載已有中國(guó)狼研究中20個(gè)mtDNA控制區(qū)序列，然后重新劃分單倍型，用鄰接法 (Neighbour-joining，NJ)以 Genbank下載的郊狼線粒體控制區(qū)序列(Canis latrans, Genank登錄號(hào)：NC_008093)為外群構(gòu)建單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，其中各節(jié)點(diǎn)的支持率根據(jù)各序列bootstrap[17]1000次重抽樣后數(shù)據(jù)計(jì)算。根據(jù)單倍型變異位點(diǎn)，應(yīng)用軟件Network 4.610 (http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm)構(gòu)建基于Median-Joining法簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)(Statistical parsimony network)關(guān)系圖，以期與已有研究進(jìn)行比較。為了解中國(guó)狼在世界范圍內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化地位，下載了123個(gè)世界各地狼線粒體控制區(qū)單倍型(附表)，并以8個(gè)郊狼單倍型序列(附表)為外群使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 線粒體控制區(qū)HVRⅠ基因序列及其變異

圖1 中國(guó)部分地區(qū)狼線粒體第一高變區(qū)多態(tài)位點(diǎn)分布圖Fig.1 Variable sites distribution of HVR Ⅰ in mtDNA of China Wolf

實(shí)驗(yàn)獲得44個(gè)中國(guó)狼線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)583 bp序列，其中內(nèi)蒙西旗，內(nèi)蒙達(dá)賚湖自然保護(hù)區(qū)，青海湖區(qū)，青海剛察，新疆青河縣樣品全部擴(kuò)增測(cè)序成功(表2)。通過(guò)比對(duì)44個(gè)線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ序列發(fā)現(xiàn)共有變異位點(diǎn)51個(gè)，占分析序列長(zhǎng)度的8.76%，插入缺失位點(diǎn)11個(gè)，堿基替換位點(diǎn)40個(gè)(圖1)。研究表明，通過(guò)擴(kuò)增總DNA的方法有可能擴(kuò)增出核基因組中線粒體基因插入拷貝[18-20]，即線粒體假基因(Numts)。由于線粒體假基因和線粒體基因分歧度較大，這時(shí)應(yīng)考慮青海種群是否存在這樣的假基因。將青海種群線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ基因分別與Genbank中下載先前研究的中國(guó)青海狼序列(FJ032363)以及中國(guó)內(nèi)蒙狼序列(GQ374438)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)青海狼與中國(guó)西藏狼序列相似度超過(guò)97.5%，而與中國(guó)內(nèi)蒙狼序列比對(duì)結(jié)果與表4結(jié)果相符，證明青海種群確實(shí)與其他種群存在較大的分歧。其中轉(zhuǎn)換/顛換之比R為5.71，說(shuō)明序列突變未達(dá)到飽和狀態(tài)[21]。

各地區(qū)種群的線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ基因堿基組成分析：A，T，C，G平均含量分別是26.29%、30.24%、16.62%和26.85%，其中A+T含量為56.53%，符合脊椎動(dòng)物線粒體基因組成特點(diǎn)，低于犬科動(dòng)物線粒體全序列A+T含量(60.3%—60.5%)[22]，表明HVR Ⅰ相對(duì)于其他保守的線粒體基因組區(qū)段來(lái)說(shuō)較易突變。

表2 狼樣品測(cè)序結(jié)果信息表Table 2 The wolf sample sequencing results table

2.2 線粒體Cytb基因序列及其變異

實(shí)驗(yàn)共獲得40個(gè)狼線粒體Cytb序列(表2)。將擴(kuò)增測(cè)序所得到40條的長(zhǎng)度為767 bp的序列經(jīng)Clustal X[2]比對(duì)去掉含有的tRNApro序列后得到582 bp的Cytb部分序列。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基插入及缺失現(xiàn)象，表明這些Cytb序列來(lái)自于線粒體，而不是核基因中的線粒體假基因[23]。使用MEGA 5.0分析這40條Cytb序列發(fā)現(xiàn)其堿基組成為：T 29.0%、C 29.6%、A 29.9%、G 11.6%。582個(gè)堿基位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)31個(gè)，占分析序列的5.33%，且變異位點(diǎn)全部為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)單核苷酸變異位點(diǎn)。40個(gè)個(gè)體總的轉(zhuǎn)換顛換比(R)為28.68，各地理種群轉(zhuǎn)換顛換比均大于2.0，與動(dòng)物線粒體堿基替換模式結(jié)論相符[18]。狼Cytb部分序列G+C含量為41.2%，與脊椎動(dòng)物基因序列G+C含量在40%—50%之間的結(jié)論相符[24]。密碼子第一位點(diǎn)G+C含量(50.2%)明顯高于第二位點(diǎn)(40.2%)和第三位點(diǎn)(38.2%)的含量，表明密碼子第二三位點(diǎn)開(kāi)始傾向于富含AT(表3)。

表3 狼Cyt b部分序列基因密碼子同位點(diǎn)的堿基組成平均值/%Table 3 Base compositions averagement for Cyt b partial sequenees of Wolf in the 1st,2nd,3rd position of the genetic codons

2.3 基于線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ中國(guó)部分地區(qū)狼遺傳多樣性分析

使用軟件DnaSP 5.0對(duì)44個(gè)成功獲得目的個(gè)體樣本片段序列進(jìn)行分析，共確定16個(gè)單倍型，其中青海種群內(nèi)部青海剛察與青海湖區(qū)種群共享3個(gè)單倍型(QH2，QH3，QH4),新疆種群內(nèi)部新疆阿勒泰地區(qū)及青河縣種群共享1個(gè)單倍型XJ2，內(nèi)蒙種群內(nèi)部?jī)?nèi)蒙達(dá)賴湖自然保護(hù)區(qū)，西旗及呼倫貝爾種群共享2個(gè)單倍型NM2和NM4，吉林圖門與內(nèi)蒙呼倫貝爾種群共享1個(gè)單倍型NM3(表4)。吉林圖門與內(nèi)蒙呼倫貝爾種群之間共享1個(gè)單倍群，說(shuō)明兩個(gè)種群之間表現(xiàn)為共同的母系來(lái)源或存在基因交流。

表4 線粒體控制區(qū)HVRⅠ單倍型及變異位點(diǎn)信息Table 4 Haplotypes and variable sites within the HVR Ⅰ of mitochondrial control region

由于吉林圖門種群數(shù)量小于3，不符合Tajima檢驗(yàn)[25]要求至少3條同源原序列的要求，所以選取符合條件的青海，內(nèi)蒙和新疆種群進(jìn)行遺傳多樣性分析。使用DnaSP 5.0軟件對(duì)分布在中國(guó)青海、內(nèi)蒙、新疆3個(gè)種群44個(gè)個(gè)體測(cè)得的線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ進(jìn)行遺傳分析后得出，中國(guó)種群?jiǎn)伪缎投鄳B(tài)性Hd為0.897，核苷酸多態(tài)性Pi為0.02278。新疆種群的核苷酸多樣性為0.942，明顯的高于另外兩個(gè)種群，說(shuō)明新疆種群遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富。通過(guò)Tajima′s D 和Fu and Li′s D 值檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.10)表明這3個(gè)中國(guó)狼種群相對(duì)于中性進(jìn)化的歧異度沒(méi)有明顯的偏離(表5)。

表5 中國(guó)狼3個(gè)地理種群43個(gè)糞便樣品線粒體DNA HVR Ⅰ遺傳多樣性分析Table 5 Analysis of the genetic diversity of mitochondrial DNA HVR Ⅰ for 42 individuals in three populations of Chinese wolves

*P>0.10無(wú)顯著差異

從Genbank下載的中國(guó)各地區(qū)的基于線粒體控制區(qū)序列20個(gè)灰狼的線粒體控制區(qū)序列(附表)。由于下載的序列長(zhǎng)度存在差異，所以我們將所有序列剪輯后得到長(zhǎng)度為582 bp的線粒體控制區(qū)序列?；?82 bp的序列重新劃分中國(guó)狼單倍型，發(fā)現(xiàn)28個(gè)單倍型，并重新對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，其中NM2(W2)，NM4 (W4)，QH2 (W7)，QH3 (W8)，QH4 (W9)，XJ3 (W16)與以前研究中發(fā)現(xiàn)的單倍型完全匹配(附表)。

圖2 基于中國(guó)狼mtDNA控制區(qū)28單倍型序列構(gòu)建的NJ樹(shù)(a)和基于中國(guó)狼mtDNA控制區(qū)28單倍型序列構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(b)Fig.2 Neighbor-joining tree of 28 mtDNA haplotypes based on mtDNA D-loop of China wolf (a)and Network of 28 mtDNA haplotypes based on mtDNA D-loop of China wolf (b)圓圈代表的是單倍型，紅點(diǎn)代表的是假定的中間單倍型， 線代表一個(gè)替位突變, 圈的大小與單倍型頻率的大小成正比

2.4 分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)Genbank下載的20條中國(guó)狼線粒體控制區(qū)序列與比研究發(fā)現(xiàn)的單倍型對(duì)后重新定義28個(gè)單倍型。通過(guò)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)本研究發(fā)現(xiàn)的線粒體控制區(qū)單倍型與Tsuda,K等[26]在蒙古烏蘭巴托附近發(fā)現(xiàn)的狼單倍型共享3個(gè)單倍型，與羅理?xiàng)頪7]等發(fā)現(xiàn)的單倍型共享4個(gè)單倍型(附表)。使用NJ法構(gòu)建28個(gè)中國(guó)狼單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，除青海種群外，其他地區(qū)或亞地區(qū)的的狼單倍型并沒(méi)有聚集在一起，表明地區(qū)或亞地區(qū)狼在遺傳學(xué)方面沒(méi)有獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)[7]。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)不難看出，青海種群?jiǎn)伪缎团c除青藏高原外的單倍型基于遺傳距離分屬兩個(gè)不同的世系，這與羅理?xiàng)畹人玫慕Y(jié)果一致[7]。把得到的28個(gè)中國(guó)狼單倍型與Genbank上下載的123個(gè)灰狼單倍型序列構(gòu)建NJ樹(shù)發(fā)現(xiàn)，位于青藏高原及其周邊地區(qū)的狼與喜馬拉雅山脈西側(cè)的印度狼親緣關(guān)系較近并為一支，而廣布于中國(guó)其他地區(qū)的狼單倍型與歐亞狼親緣關(guān)系較近，且沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的與地理分布有關(guān)的差異(圖3)。

圖3 基于從Genbank下載的225bp的線粒體控制區(qū)序列，使用K2P堿基替換模型構(gòu)建的環(huán)形NJ樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining original tree, computed using a nucleotide substitution model with Kimura 2 parameter distances, illustrating the phylogenetic relationship among wolf 225bp mtDNA control region haplotypes registered in GenBank

2.5 分化時(shí)間估計(jì)

基于Cytb序列，利用已經(jīng)校正的哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素b序列的每百萬(wàn)年2%分子鐘來(lái)計(jì)算中國(guó)各地狼進(jìn)化分歧時(shí)間?；贙imura雙參數(shù)距離模型，計(jì)算中國(guó)各地狼的遺傳距離，其中內(nèi)蒙、新疆與吉林種群遺傳距離數(shù)值范圍為0.002—0.006 MYA Bp，其種群分歧時(shí)間大約為0.05—0.15 MYA Bp。青海狼與本研究其他地理種群遺傳距離較遠(yuǎn)，遺傳距離為0.043—0.048，由此得出青海種群與其他地理種群分歧時(shí)間大約在1.08—1.2 MYA Bp，巧合的是這與青藏高原受地質(zhì)作用的急速隆起時(shí)間(0.9—1.1 MY)相近[27]。

3 討論

狼分布范圍廣，野外活體采樣難度很大。本文嘗試從糞便中成功的提取總DNA，為今后通過(guò)使用糞便樣品對(duì)狼進(jìn)行遺傳進(jìn)化研究提供了依據(jù)。本研究從55個(gè)樣品中成功的提取和擴(kuò)增出出44個(gè)個(gè)體的線粒體HVR Ⅰ和40個(gè)Cytb序列，其中未成功提取出DNA的樣品全部為糞便樣品，而且主要為內(nèi)蒙呼倫貝爾地區(qū)樣品。未提取出來(lái)的原因可能是采集的糞便樣品時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品中的DNA降解或者糞便樣品中含有可抑制后續(xù)反應(yīng)的酶[28]。

對(duì)種群進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估，不僅有利于了解種群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)，而且為制定種群保護(hù)和管理措施提供依據(jù)。通?？紤]一個(gè)種群遺傳多樣的高低主要是通過(guò)對(duì)比種群內(nèi)部單倍型間的遺傳距離和核苷酸多態(tài)性，然而由于核苷酸多態(tài)性充分考慮到了單倍型在種群內(nèi)的比例，所以一般使用核苷酸多態(tài)性來(lái)衡量一個(gè)種群遺傳多樣性的高低[29]。本研究利用線粒體HVR Ⅰ序列對(duì)中國(guó)4個(gè)地理狼種群進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)平均核苷酸多態(tài)性為2.27%，與世界其他地區(qū)狼相比遺傳多樣性是較高的，如Randi等[30]通過(guò)分析mtDNA控制區(qū)序列發(fā)現(xiàn)保加利亞狼核苷酸多樣性為0.26%，Pilot[31]等在東歐十多個(gè)國(guó)家采集到643只狼樣品，并成功地鑒定出21個(gè)線粒體DNA單倍型，得出其核苷酸多樣性為1.7%，Tomislav等[32]分析了91只狼的線粒體控制區(qū)序列得出克羅地亞狼遺傳多樣性為1.8%，從而說(shuō)明中國(guó)狼相對(duì)于世界其他國(guó)家和地區(qū)來(lái)說(shuō)線粒體D-loop區(qū)存在豐富的多樣性。

通過(guò)構(gòu)建的中國(guó)狼分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，青海種群與西藏狼明顯的并為一支，而其他地區(qū)的狼則沒(méi)有按照地理區(qū)劃分成不同的譜系，同時(shí)各個(gè)譜系間含有共同的單倍型，說(shuō)明其遺傳基礎(chǔ)一致，存在著基因交流，這與北美狼亞種分化的研究是一致的[33]。t檢驗(yàn)也顯示了吉林，內(nèi)蒙，新疆種群之間的遺傳距離無(wú)顯著差異，而與青海種群差異明顯。其中青海種群擁有較多的單倍型，且通過(guò)世界狼系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)不難看出，青海種群擁有的單倍型較為特殊，不與除青藏高原及周邊地區(qū)外的中國(guó)其他地區(qū)的狼單倍型相似，而是與喜馬拉雅山山脈西部位于印度等國(guó)家地區(qū)的狼接近，通過(guò)青海種群的分布區(qū)域考慮，青海種群位于青藏高原東北部的青海湖周邊地區(qū)，北面為昆侖山和祁連山，東面為橫斷山脈，平均海拔在3000m以上，山地可以達(dá)到4000m以上，這些天然的地理屏障阻礙了青海種群與青藏高原外的其他地理種群進(jìn)行基因交流，長(zhǎng)期的地理隔離造成青海種群獨(dú)立進(jìn)化形成了隔離種群。而青海種群與西藏狼，云南狼共享單倍型，說(shuō)明了青海種群與西藏云南種群在起源進(jìn)化上關(guān)系比較近。

長(zhǎng)久以來(lái)，研究認(rèn)為中國(guó)狼只有一個(gè)亞種即C.l.Chanco[4-5]。Tsuda K等[26]通過(guò)研究狼的3個(gè)亞種(C.l.lupus，C.l.pallipesandC.l.Chanco) 發(fā)現(xiàn)中國(guó)狼(C.l.Chanco)的線粒體控制區(qū)變異較其他兩個(gè)亞種較大,而我們通過(guò)對(duì)比線粒體控制區(qū)部分序列發(fā)現(xiàn)，除青海地區(qū)序列與另外兩個(gè)亞種序列差異較大外，其他地區(qū)種群?jiǎn)伪缎团c另外兩個(gè)亞種差別不大。Ramesh K Aggarwal 等[34]利用Tsuda K 等[26]從蒙古國(guó)烏蘭巴托發(fā)現(xiàn)的狼的線粒體單倍型與印度西部喜馬拉雅山脈狼進(jìn)行比較，得出印度西部喜馬拉雅山脈狼是與蒙古狼是完全不同的，并推測(cè)其是世界上最古老的狼世系，這與的研究結(jié)果一致?；诰€粒體DNA的研究結(jié)果，Dinesh等[35]認(rèn)為可以將位于印度喜馬拉雅山脈附近狼種群從中國(guó)狼或蒙古狼亞種(C.l.Chanco)中剝離出來(lái)一起劃歸為西藏亞種(C.l.langier)。通過(guò)本文研究，并結(jié)合以前形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)上的研究結(jié)果[36]推測(cè)青藏高原種群的狼可能與印度喜馬拉雅山附近的狼同屬于西藏狼亞種(C.l.langier)，當(dāng)然這只是推測(cè)，具體的情況還需要從解剖生理學(xué)，基因組學(xué)乃至古生物學(xué)的證據(jù)來(lái)證實(shí)。同時(shí)通過(guò)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)也能看到除青藏高原及周邊地區(qū)的狼外中國(guó)其他地區(qū)的狼單倍型廣布于歐亞大陸乃至北美大陸狼分支中，說(shuō)明這些地區(qū)的狼起源進(jìn)化關(guān)系較為復(fù)雜。

4 結(jié)論

基于線粒體控制區(qū)部分序列測(cè)定及分析，研究結(jié)果表明中國(guó)狼較世界其他國(guó)家地區(qū)擁有較高的遺傳多樣性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明中國(guó)狼可以分為兩個(gè)世系，且位于青藏高原及其周邊地區(qū)的狼與中國(guó)其他地區(qū)的狼遺傳結(jié)構(gòu)差異較大，且其遺傳多樣性較其他地區(qū)低。推測(cè)其在進(jìn)化上與中國(guó)其他地區(qū)狼較早出現(xiàn)分歧，并形成獨(dú)立進(jìn)化種群。利用線粒體Cytb部分序列推算各地理種群的進(jìn)化分歧時(shí)間得出，位于青藏高原種群與其他地理種群分歧時(shí)間大約在1.1 MY前，與青藏高原受地質(zhì)作用急速隆起時(shí)間相近。

致謝：中國(guó)科學(xué)院西北高原生物所、青海動(dòng)物園、哈爾濱野狼湖狼園、新疆富疆狼園、內(nèi)蒙古達(dá)賚湖自然保護(hù)區(qū)提供研究樣品,東北林業(yè)大學(xué)高中信教授、曲阜師范大學(xué)劉廣帥同學(xué)為采集樣品提供指導(dǎo)與幫助，特此致謝。

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Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical regions of China

ZHANG Honghai1,*, DOU Hailong1,2, CHEN Lei1, SHA Weilai1, ZHAO Junjie1

1CollegeofLifeScience,QufuNormalUniversity,Qufu273165,China2CollegeofLifeScience,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China

Wolves were once widely distributed throughout China. The number of Chinese wolves has drastically declined in recent years as a result of environmental destruction and habitat loss. At present, wolves in China are mainly distributed in sparsely populated western and northern regions of the country. To protect this species, an understanding of genetic diversity and phylogenetic relationships of wolf populations in China is necessary. In this study, we analyzed the partial mitochondrial DNA (mtDNA) D-loop region and the Cytb(Cytochrome b)gene of wolves originating from four distinct geographical populations in Xinjiang, Qinghai, Inner Mongolia, and Jilin. Using standard molecular biology techniques, we generated sequences of the mtDNA control region hypervariable region I (HVR I) from 44 wolves, and sequences of the Cytbgene from 40 wolves. The resulting 582-bp HVR I sequence alignment contained 51 variable sites, which corresponded to 8.76% polymorphic loci. Similarly, 31 variable sites, all base substitutions, were identified in the aligned Cytbsequence data set. We detected 16 haplotypes among the 44 HVR I gene sequences. The Inner Mongolian population and the population from Jilin were found to share the same HVR I haplotype. When this data set was combined with previously generated Chinese wolf sequences available in Genbank, a total of 28 haplotypes from approximately 91 Chinese wolves were identified. To explore the genetic diversity of these geographic populations, we calculated nucleotide diversity and haplotype diversity from the HVR I sequences. The population from XinJiang was found to have the highest genetic diversity. When we compared these results with previously reported nucleotide diversities of wolves from other countries and regions, we found that Chinese wolves had the highest nucleotide diversity. In the phylogenetic tree generated using the HVR I haplotypes, Chinese wolves are primarily divided into two lineages. The first lineage comprises haplotypes of wolf populations from the Qinghai-Tibet Plateau and surrounding areas. There is no obvious relationship with geographical structure among the remaining wolf haplotype groups. Considering their high level of genetic diversity and restricted geographic distribution, we speculate that the Qinghai-Tibet Plateau populations have evolved in isolation over a long period of time. To investigate the phylogenetic position of Chinese wolves, we downloaded 123 mtDNA partial control region sequences from Genbank, which were obtained from wolves primarily distributed in Eurasia and North America. In the phylogenetic tree generated from these sequences, wolf populations from the Qinghai-Tibet Plateau are clearly separated from wolves from other regions of China. The results of this phylogenetic analysis suggest that wolf populations in the Qinghai-Tibet Plateau of China comprise an ancient lineage that is still extant in these higher elevation regions. Based on genetic distances calculated using Ctybsequence data, we estimate that the two lineages diverged about 1.1 million years ago, corresponding to the time period during which the Qinghai-Tibet Plateau was suddenly uplifted by geological processes. Based on these results, we propose that the wolves of the Qinghai-Tibet Plateau and the widespread wolfCanislupuschancoare not the same subspecies.

wolf; China; genetic diversity; evolution

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172119, 31372220); 山東省自然科學(xué)基金(ZR2011CM009, ZR2010CL014); 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金(博導(dǎo)類)(20113705110001)

2013-05-22;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305221141

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhanghonghai67@126.com

張洪海，竇海龍，陳磊，沙未來(lái)，趙俊杰.中國(guó)狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(6):1869-1881.

Zhang H H, Dou H L, Chen L, Sha W L, Zhao J J.Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical regions of China.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1869-1881.